基于二维液相色谱-高分辨质谱联用技术的大规模合成寡核苷酸色谱分析平台开发及应用

本研究针对大分子合成寡核苷酸（如100-mer sgRNA）在质谱检测中存在的灵敏度低、杂质分离困难等问题，开发了一种创新的二维液相色谱-质谱（2DLC-MS）平台。通过多中心切割分馏、加合物去除和宽窗口四极杆隔离采集技术，实现了对CRISPR-Cas9系统中单链向导RNA（sgRNA）的IP-RPLC和低温HILIC色谱图谱的深度解析。该技术显著提升了质谱灵敏度，为寡核苷酸治疗药物的质量控制提供了全新解决方案。

　　

基因编辑技术的革命性突破使CRISPR-Cas9系统成为生物医学领域的明星工具，其中单链向导RNA（sgRNA）作为引导Cas9蛋白精准定位的"分子导航"，其质量直接影响基因编辑效率。然而，长达100个核苷酸的合成sgRNA在制备过程中会产生复杂杂质，传统分析方法如离子对反相液相色谱（IP-RPLC）与质谱联用时面临灵敏度不足、色谱分离效果差等瓶颈问题，严重制约了对这类大分子寡核苷酸的质控能力。

发表在《Analytica Chimica Acta》的研究通过创新性技术组合破解了这一难题。研究人员开发了二维液相色谱-质谱（2DLC-MS）分析平台，其核心技术包括：1）第一维采用常规IP-RPLC或HILIC分离；2）第二维通过20 mM哌啶/乙腈-水溶液实现加合物去除；3）采用50 m/z窗口的四极杆隔离采集策略提升信噪比。以两种不同工艺制备的100-mer sgRNA为样本，系统比较了其杂质谱特征。

研究结果部分显示：在"2DLC-MS平台提升灵敏度"章节，通过比较直接MS检测与2DLC-MS平台的信噪比，证实新方法使低丰度杂质的检测限提升10倍以上。"低温HILIC分离优化"部分发现降低柱温至15°C可显著改善大分子寡核苷酸的色谱峰形。在"工艺比较应用"中，研究团队成功鉴别出两种生产工艺产生的不同杂质特征，包括N-1缺失序列和磷酸化修饰产物。

该研究的突破性在于：首次建立可同时兼容IP-RPLC和HILIC分离模式的通用型2DLC-MS平台，通过创新性的第二维洗脱体系（哌啶/乙腈-水）有效去除钠/钾离子加合物干扰，结合宽窗口四极杆隔离技术克服了大分子离子化效率低的难题。这不仅为CRISPR-Cas9系统中sgRNA的质量控制提供了新工具，更为其他大分子治疗性寡核苷酸（如mRNA疫苗、反义寡核苷酸等）的杂质分析建立了方法学范式。研究揭示的工艺相关杂质特征，对优化固相磷酸酰胺化学合成工艺具有重要指导价值，最终将提升基因治疗产品的安全性和有效性。