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为探究慢速冷冻对犬窦前卵泡（PAFS）形态及活力的影响，研究人员分离不同年龄犬卵巢皮质 PAFS，分新鲜对照组与慢速冷冻组培养。发现冻融卵泡活细胞率、激素分泌较低，培养中后期面积更大。为犬生殖保存提供参考。
在辅助生殖与物种遗传资源保护领域，犬类生殖细胞的冷冻保存一直是难点。犬作为独特的模型动物，其卵母细胞因高脂质含量和特殊发情周期，对冷冻损伤极为敏感。目前，犬窦前卵泡（PAFS）的冷冻保存研究多集中于玻璃化冷冻，而慢速冷冻这一在其他哺乳动物中应用成熟的技术，在犬类中的效果与机制尚不明确。如何平衡冷冻保护剂渗透与细胞内冰晶形成，维持卵泡结构完整性，成为犬生殖保存领域亟待解决的问题。
为填补这一研究空白，匈牙利兽医大学（University of Veterinary Medicine, Budapest）的研究人员开展了犬窦前卵泡慢速冷冻的体外培养研究，相关成果发表在《Animal Reproduction Science》。该研究旨在评估慢速冷冻对犬 PAFS 解冻后活力与功能的影响，探讨其作为犬生殖保存技术的可行性。
研究人员从 10 只不同年龄（2.57±1.26 年）的绝育母犬中收集卵巢，通过基于胶原酶的消化液分离窦前卵泡，随机分为新鲜对照组与慢速冷冻组。新鲜及冻融卵泡在含 10% 胎牛血清（FBS）的培养基中单独培养 10 天，培养条件为 38.5℃、6.5% CO?，分别在第 2、5、10 天更换半量培养基并收集样本用于激素分析。研究检测了解冻后活细胞率、正常形态率、面积变化及雌二醇（E?）和孕酮（P?）分泌水平。
研究采用的关键技术包括：
- 卵巢组织处理：通过手术采集卵巢，用含 FBS 的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）保存运输。
- 卵泡分离：利用胶原酶消化法从卵巢皮质分离窦前卵泡。
- 慢速冷冻保存：采用程序化慢速冷冻流程对卵泡进行冻存。
- 体外培养：单细胞微滴培养技术，动态观察卵泡生长。
- 细胞活力与功能检测：台盼蓝染色评估活细胞率，形态学观察记录结构完整性，酶联免疫吸附试验（ELISA）测定激素水平。
解冻后活力分析
台盼蓝染色显示，慢速冷冻组解冻后活细胞率显著低于新鲜对照组（94.69%±6.97 vs 98.58%±1.71，p<0.05），表明慢速冷冻对卵泡细胞存在一定损伤。
形态学变化
培养第 2 天，新鲜组正常形态率（91.2%）显著高于冷冻组（50%，p<0.05），但两组形态异常率随培养时间均呈上升趋势，至培养结束时差异消失，提示冷冻损伤可能在培养初期更为明显。
卵泡生长动力学
培养第 5 天和第 10 天，冷冻组卵泡面积显著大于新鲜组（5.84 vs 12.62 mm2，p<0.005；6.47 vs 10.75 mm2，p<0.05），暗示慢速冷冻可能通过某种机制促进卵泡后期生长，但其生物学意义尚需进一步验证。
激素分泌能力
整个培养周期内，冷冻组 E?和 P?浓度均低于新鲜组，表明慢速冷冻可能损害卵泡颗粒细胞的内分泌功能，影响卵泡成熟微环境的建立。
研究结果表明，慢速冷冻可实现犬窦前卵泡的存活，但会导致卵泡活力与质量下降，表现为活细胞率降低、早期形态异常率升高及激素分泌能力受损。值得注意的是，冷冻组卵泡在培养中后期表现出更大的生长面积，这一现象与该团队此前玻璃化冷冻研究中 OPS 法（开放拉管法）的结果形成对比，提示不同冷冻方法对卵泡生长调控的机制存在差异。
讨论指出，犬 PAFS 的慢速冷冻面临与玻璃化冷冻不同的挑战。尽管慢速冷冻通过缓慢脱水减少了渗透压损伤风险，但犬卵母细胞的高脂质特性可能使其对低温更敏感，导致细胞内冰晶形成或脂质相变，进而影响细胞活力。此外，冷冻保护剂的毒性作用及卵泡结构复杂性（如多层颗粒细胞与基底膜）可能加剧冷冻损伤。该研究为犬生殖保存技术的优化提供了重要数据，证实慢速冷冻作为备选方案的可行性，同时强调需进一步调整冷冻程序（如冷冻保护剂种类、降温速率）以提升效果。
该研究的意义在于首次系统评估了慢速冷冻对犬 PAFS 的影响，为犬类辅助生殖技术及濒危犬科物种遗传资源保存提供了新视角。结合前期玻璃化冷冻研究，提示针对犬类特殊生理特性，需开展多技术路线对比，以筛选最优冷冻方案。未来研究可聚焦于冷冻损伤分子机制（如氧化应激、凋亡通路），通过添加抗氧化剂或基因调控手段改善卵泡冷冻后发育潜能。
