温度调控LasR对铜绿假单胞菌piv基因表达的调控机制及其在致病性中的意义

本研究揭示了铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）毒力因子蛋白酶IV（PIV）的温度依赖性转录调控机制，发现群体感应调控因子LasR在25°C下显著激活piv表达，而37°C时作用减弱。通过启动子突变和蛋白定量分析，阐明了温度通过LasR间接调控piv的独特模式，为理解环境信号（如温度）与群体感应（QS）系统的交互提供了新视角，对开发针对角膜/肺部感染的干预策略具有潜在意义。

　　

温度调控LasR对铜绿假单胞菌piv表达的调控机制

ABSTRACT
铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）作为机会性病原体，其毒力因子蛋白酶IV（PIV）的表达受温度和群体感应系统LasRI调控。研究发现，piv在25°C的静止期表达量比37°C高16倍，且该调控发生在转录水平。LasR在25°C下显著激活piv启动子，但LasR蛋白丰度和自诱导剂3O-C12-HSL浓度并未随温度升高而改变，提示温度通过未知机制特异性影响LasR对piv的调控。

INTRODUCTION
铜绿假单胞菌通过温度感知适应不同宿主环境。此前研究多关注毒力因子的转录后调控，而piv作为降解免疫分子（如乳铁蛋白、IL-22）的关键蛋白酶，其转录调控机制尚不明确。已知LasR通过结合las box激活靶基因，但piv启动子中的非典型las box（16T→G突变可增强活性）提示其调控具有温度敏感性。

RESULTS
生长阶段依赖性调控：piv在静止期呈现连续温度响应（25°C>30°C>37°C>42°C），而指数期无差异。免疫印迹显示成熟PIV蛋白（26 kDa）在25°C丰度最高，与转录水平一致。

转录水平调控：200 bp启动子驱动的GFP报告基因证实，25°C下启动子活性比37°C高10倍。ΔlasR或ΔlasI菌株中启动子活性完全丧失，而ΔmvaTΔmvaU双突变体在37°C出现去抑制，提示H-NS家族蛋白的阻遏作用受温度影响。

LasR活性机制：lasR基因表达、LasR蛋白及3O-C12-HSL浓度均无温度依赖性变化，排除经典QS系统自身温度敏感的可能性。

启动子元件分析：5′ RACE鉴定转录起始位点（151C/152G），SAPPHIRE预测σ⁷⁰依赖的-35/-10区。突变假定的las box（如1C→A）使25°C下启动子活性降低80%，而16T→G突变增强37°C活性，表明该序列是温度敏感调控的关键元件。

DISCUSSION
研究提出两种模型：①LasR直接结合piv启动子时，低温可能通过DNA热敏二级结构促进结合；②LasR激活未知因子间接调控piv。值得注意的是，piv在低温下的高表达可能与其在自然环境（非哺乳动物宿主）中的功能相关，而铁调控因子PvdS可在感染期补偿其表达。

MATERIALS AND METHODS
实验采用PAO1菌株，通过RT-qPCR（内参基因omlA）、定量免疫印迹（αVSV-G/αLasR抗体）和3O-C12-HSL生物报告系统（大肠杆菌传感菌株）验证假设。启动子突变体通过位点定向PCR构建，温度梯度培养（25°C–42°C）结合生长曲线同步监测。

该研究首次揭示温度通过LasR特异性调控单一毒力基因的机制，为复杂环境信号整合至QS网络提供了范例。