细菌天然分离株中线性双着丝粒染色体的发现揭示复制子融合的普遍约束机制

这篇研究揭示了土壤农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）自然分离株中存在染色体融合现象，通过Hi-C（染色体构象捕获）、Tn-seq（转座子测序）和MFA（标记频率分析）技术，证实融合后双着丝粒染色体仍保留独立复制起源（ori1/ori2）和分离系统（parAB/repABC），且XerCD-dif重组系统对其生存至关重要。研究为多分区基因组（multipartite genome）的进化约束和适应性提供了新见解。

　　

INTRODUCTION
大多数细菌基因组为单分区（monopartite）结构，但约10%的物种如土壤农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）具有多染色体系统。这类基因组结构常见于病原体或共生菌，如根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）和霍乱弧菌（Vibrio cholerae），其进化可能与生态位适应相关。实验室菌株C58曾被发现其环状染色体（Ch1）与线性染色体（Ch2）融合为双着丝粒染色体，但自然环境中是否存在类似现象尚不明确。

RESULTS
自然分离株中的融合染色体
通过对400余株土壤农杆菌进行纳米孔测序，发现两株地理隔离的葡萄病原菌（CFBP_2407和CFBP_2642）携带融合染色体。核心基因组系统发育分析显示，二者与二元染色体结构的菌株47-2亲缘最近（ANI>99.3%）。Hi-C技术证实融合染色体呈线性连续结构，无二元染色体的断点特征。

融合位点的鉴定
基因组比对和Hi-C数据揭示，融合发生于Ch1的2,156 kb和Ch2的1,161 kb处，涉及高度同源的rRNA基因簇（rrn2/rrn3）。值得注意的是，融合位点侧翼存在77 kb的ICE（接合转座子样元件），但其在进化中的角色仍需验证。与C58实验室融合株相比，自然分离株的融合位点完全不同，表明该过程存在多路径机制。

双复制起源的活性与必要性
MFA显示融合染色体的ori1和ori2均保持独立复制活性，复制速率与二元染色体相当。Tn-seq进一步证实，两套分离系统（parAB和repABC）在融合株中仍为必需基因，说明双着丝粒的维持需要协同调控。

XerCD-dif系统的关键作用
Tn-seq发现酪氨酸重组酶XerCD在融合株中为必需基因，而在二元株中非必需。该系统的功能依赖于FtsK极性序列（KOPS, GGGNAGGG）将dif位点引导至分裂 septum，以解决复制后的分配冲突。融合染色体的生存依赖此机制，避免因50%的子代细胞因起源分配错误而死亡。

DISCUSSION
自然分离株与实验室C58融合株的共性包括：1）同源序列介导的融合；2）保留双复制起源与分离系统；3）复制臂（replichore）长度平衡；4）依赖XerCD-dif系统。ICE的插入可能触发融合事件，但其普遍性仍需探究。研究揭示了多分区基因组的动态平衡机制，为理解细菌基因组可塑性和进化约束提供了范例。

MATERIALS AND METHODS
实验采用ATGN培养基培养菌株，通过纳米孔测序和Unicycler组装基因组。Hi-C使用HindIII酶切和生物素标记，Tn-seq基于Mariner转座子文库。数据分析涉及MAFFT比对、IQ-TREE2构建系统发育树，以及自定义Python脚本生成共线性图谱。

（注：全文严格依据原文内容缩编，未添加非文献支持结论）