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本文综述石墨烯介导的表面增强拉曼光谱（G-SERS）在 DNA 检测与杂交中的应用进展。聚焦金、银纳米颗粒对信号强度的提升作用，探讨 G-SERS 与石英晶体微天平（QCM）、原子力显微镜（AFM）等联用的创新方法，展望其在基因检测等生物医学领域的潜力与挑战。
表面增强拉曼光谱（SERS）是现代光谱分析技术的前沿，具有超灵敏度和特异性，可检测和鉴定目标分子。其核心是利用拉曼散射现象，当分子靠近纳米级金属结构时，拉曼信号会大幅增强，这种增强主要来自电磁机制，通过表面等离子体共振激发，在金属纳米结构表面产生局部场增强。银和金纳米颗粒因能激发局域表面等离子体共振（LSPR），在 SERS 中发挥重要作用，其组成、尺寸、形状、聚集状态及激发激光波长等因素都会影响拉曼增强效果。非球形纳米结构如纳米星、纳米立方体等，因具有尖锐尖端、边缘和不对称几何结构，能更有效地集中电磁场，比球形颗粒更有利于增强 SERS 效应。纳米颗粒尺寸也至关重要，例如 50-60 nm 直径的银纳米球在 785 nm 激发下对罗丹明 6G（R6G）产生最高 SERS 信号。“热点” 密度同样关键，密集堆积的纳米颗粒因 “热点” 数量多，SERS 效应更强。此外，除电磁增强机制外，SERS 还存在化学增强（CE）机制，源于分子吸附到金属基质上时极化率的变化，通过金属与吸附分子之间的电荷转移实现。
二维（2D）材料因其独特的电子、结构和化学性质，成为先进 SERS 基底的重要组成部分，虽大多本身不具有等离子体特性，但可通过化学机制如电荷转移相互作用促进 SERS 增强，还能与贵金属纳米颗粒结合形成混合结构。常用的二维材料包括石墨烯相关材料、六方氮化硼（h-BN）、过渡金属二硫属化物（TMDs）和 MXenes 等。其中，石墨烯是单层碳原子排列成的二维蜂窝状晶格，具有优异的电子、机械和热性能，其衍生物氧化石墨烯因表面含含氧官能团，具有良好的水溶性和化学反应性。从 SERS 角度看，石墨烯可通过与分子间的 π-π 相互作用产生的电荷转移化学机制，直接增强拉曼信号（即 G-SERS），修饰石墨烯片（如用氮掺杂或轻度还原）可通过缩短分子最高占据分子轨道（HOMO）与石墨烯费米能级的距离来增强信号。石墨烯与金属纳米结构协同作用时，其高表面积可作为金属纳米结构的支撑基质，提高基底稳定性，且这种协同基底可通过金属纳米结构的电磁效应和石墨烯的化学增强共同促进信号增强，同时其高导热性可有效散热，减少 SERS 实验中分子降解的风险，此外，其带负电表面和易功能化特性使其成为各种分子的有效结合表面。G-SERS 是一种前沿分析技术，利用石墨烯的独特性质提高拉曼光谱的灵敏度和精度，可检测低至飞摩尔浓度的分子，且其振动光谱和化学信息比普通 SERS 更清晰，在生物传感中可用于多种生物分子的高特异性检测与分析，尤其在 DNA 杂交检测中具有重要作用。
DNA-DNA 杂交研究在分子生物学和基因研究中至关重要，涉及互补 DNA 链的配对，为核碱基的结构、功能和相互作用提供了宝贵见解，对理解遗传信息和基因复制至关重要，在分子诊断中，DNA 杂交模式的偏差可表明基因突变、变异或与疾病相关的特定基因的存在，其应用还涉及遗传标记的鉴定、诊断工具的开发以及个性化医学、法医学和进化生物学等领域。
石墨烯因其二维蜂窝状晶格结构及优异的电子和化学性质，是 SERS 中 DNA-DNA 杂交的卓越基底，不仅可通过化学增强机制增强拉曼信号，还可作为固定 DNA 的锚定表面，使 G-SERS 在检测和分析 DNA-DNA 杂交事件时具有无与伦比的精度。例如，Botti 等人选择通过在涂有金的硅纳米柱上滴加石墨烯纳米片形成多层生物传感器系统，以增强 DNA 拉曼信号，利用高分辨率扫描电子显微镜（HR-SEM）和 SERS mapping 技术，能够区分不同类型的石墨烯材料、腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和双链 DNA 骨架，并根据信号强度推断 DNA 在表面的构象。
石墨烯 - 纳米颗粒混合纳米系统是高效的 G-SERS 基底。在 DNA 检测方面，Gao 等人开发了一种专为 DNA 检测设计的 SERS 基底，将微结构空心纤维（MHF）修饰为石墨烯和银纳米颗粒（AgNPs）的组合，使用平均直径为 150 nm 的大 AgNPs，实现了对 DNA 链中腺嘌呤的拉曼信号增强，腺嘌呤的检测限（LOD）低至约 10-14M，线性检测范围从 10-3M 到 10-14M。Muntean 等人开发了一种在酸性 pH 水平下检测 DNA 的 SERS 平台，利用原位反应混合氧化石墨烯（GO）和硝酸银，获得两种平台（石墨烯上密集的 AgNPs 和有序的 AgNPs），以结晶紫（CV）为测试对象，证明了其平台的信号增强能力，DNA 检测浓度为 1.87 和 1.95 ng/μL。Wang 等人引入创新的 GO/AgNPs/WS2平台，使用约 110 nm 大小的 AgNPs，成功检测 DNA，LOD 为 10 nM，同时对罗丹明 6G（R6G）、结晶紫（CV）、亚甲基蓝（MB）也有良好检测效果。Ouyang 等人开发了一种可重复使用的石墨烯 - AuNPs 传感器用于甲基化 DNA 检测，将 AuNPs 用特异性抗体修饰以捕获 DNA，捕获的 DNA 用拉曼标记 SYBR Green I（SG）标记，该基底经水和乙醇洗涤 5 次后仍有良好的 SERS 信号，LOD 为 1.8 pM。Cucuiet 等人设计了两种由氧化石墨烯 - 金纳米颗粒（GO-AuNPs）和聚 A 链组成的纳米平台，通过不同方式连接聚 A 链，发现氨基末端聚 A 通过 EDC 偶联直接连接到 GO 层时增强效果显著更高。
在 DNA-DNA 杂交检测方面，Khalil 等人设计了一种双平台策略，采用氧化石墨烯（GO）和 AuNPs 的三明治结构，利用 DNA 杂交时两个金纳米结构之间形成的 “热点” 增强电磁场，以 ATTO Rho6G 分子为拉曼标记，实现了对目标单链 DNA 的检测，LOD 低至 10-16M，且平台具有高选择性和特异性。Khalil 等人还开发了另一种 DNA 杂交平台，使用 Cy3 作为拉曼标记，由涂有 AuNPs 的石墨烯基底（结合 DNA 捕获探针 1）和涂有 DNA 捕获探针 2 及 Cy3 的 AuNPs 组成，LOD 为 10 fM。Duan 等人形成了由三层不同材料组成的三明治结构，以 “信号关闭” 传感器检测 DNA 杂交，通过目标 DNA 杂交后拉曼标记与 SERS 基底距离增加导致信号降低的原理，LOD 为 10 pM。Gupta 等人用贵金属纳米颗粒（金和银）装饰 GO 纳米片，检测和区分 DNA 碱基及环境相关生物分子，比较不同纳米颗粒对 SERS 增强的影响，发现 Ag30|GO 基底的增强因子（EF）最佳，LOD 为 0.1 ppm，同时通过 G-SERS 监测 DNA 杂交。Lin 等人利用 AgNPs 作为探针 DNA 与 GO 纳米复合材料之间的键合中间体及目标 DNA 的键合表面，以 4 - 巯基苯甲酸（4-MBA）分子作为杂交的 SERS 报告分子，较大尺寸的 AgNPs（57.5 nm）比小尺寸的（15.6 nm）诱导更大的拉曼信号增强，LOD 为 10-12M。Yang 等人利用蝉翼上的生物纳米柱基底，经磁控溅射沉积 AuNPs，再浸入聚烯丙胺盐酸盐（PAH）和 GO 中，还原 GO 后，通过 π-π 相互作用将 1 - 芘丁酸琥珀酰亚胺酯（PBASE）连接到基底，作为目标分子通过酰胺基团与 DNA 氨基基团的共价键连接 DNA 分子，成功检测 DNA-DNA 杂交。Fan 等人使用爆米花状 AuNPs（具有锋利边缘，增强电磁场）与 GO 的混合平台，证明该平台比单纯爆米花状 AuNPs 基底的 SERS 信号更高，可检测浓度为 500 fM 的 DNA 及低至 10 CFU/mL 的 MRSA 细菌的 HIV DNA。Babadi 等人开发了一种用于 SARS-COV-2 基因组检测的生物传感器，使用 GO 和 AuNPs 平台，涂有 Cy3 和目标探针 DNA，利用 Cy3 在 1468 cm-1处的拉曼峰强度随目标 DNA 浓度增加而增强的原理，LOD 为 0.16 ng/μL。He 等人开发了一种基于 AuNPs 和通过化学气相沉积（CVD）制备的石墨烯片的 SERS 活性基底，实现了 DNA 的多重检测，在同一传感器的不同位置沉积三种 DNA 功能化的 AuNPs，分别与混合的目标 DNA 和报告分子反应，证明了无交叉杂交的多重检测能力，LOD 为 10 pM。Xiangyu 等人采用新型三明治平台，在聚二甲基硅氧烷（PDMS）基底上用 CVD 合成石墨烯层，沉积平均尺寸约 50 nm 的 AgNPs，再覆盖另一层石墨烯，形成柔性 SERS 基底，监测基于腺嘌呤和胞嘧啶的 DNA，LOD 为 0.1 pM。
不同类型的纳米颗粒可用于放大 DNA 检测的拉曼信号，其中 AuNPs 和 AgNPs 应用最广泛，有球形、棒状、星形、爆米花状等多种形状。石墨烯融入这些平台后，不仅作为 DNA 的结合位点，还能增强拉曼信号和平台灵敏度，利用 SERS 可高灵敏度和特异性地识别和检测 DNA 及 DNA 杂交，LOD 目前可达皮摩尔到飞摩尔范围，这些混合纳米结构平台因其高灵敏度、特异性和超低 LOD，是很有前途的生物传感系统，在 DNA 鉴定、表征和检测中潜力巨大。
然而，将这种石墨烯 - 等离子体纳米颗粒混合生物（纳米）传感器转化为实际的 SERS 生物传感应用，仍存在两个关键挑战：生物传感器的重现性和标准化。对于 G-SERS 生物传感器，需要考虑纳米结构基底的活性 “热点” 数量、沉积在基底上的纳米颗粒的均匀性以及石墨烯相关材料的均匀性。尽管使用石墨烯可改善传感器的重现性和稳定性（归因于石墨烯与芳香分子之间的强疏水相互作用和 π-π 堆积，有助于将分子更好地吸附到基底上，产生一致和可重复的信号），但控制活性热点的确切数量仍是主要障碍。化学气相沉积（CVD）技术可确保石墨烯片在基底上的均匀分布，有助于传感器的均匀性，增加照明面积虽可提高 SERS 信号的重现性，但会牺牲空间分辨率，这些发现凸显了在将 G-SERS 生物传感器标准化用于临床和实际应用方面的进展和剩余障碍。
DNA 和 DNA-DNA 杂交的低浓度成功检测为生物和生物医学应用开辟了广泛领域，包括基因检测和 DNA 错配研究。基因检测方面，上述研究显示 DNA 的 LOD 低至飞摩尔范围，表明 SERS 作为高灵敏度的基因检测技术的潜力。目前，聚合酶链反应（PCR）是基因检测最广泛使用的方法之一，可扩增特定 DNA 片段，但需要预先了解 DNA 序列，不适合检测未知目标，而 SERS 无需 DNA 扩增，其极低的 LOD 可直接检测和鉴定基因和 DNA 序列，即使不知道核苷酸组成，例如在 DNA 甲基化检测中，G-SERS 是一种有效方法。
在遗传分析中，这些研究在探索以 DNA 核碱基错配为特征的基因突变方面有实际应用，基因突变涉及基因内核苷酸序列的改变，包括核碱基的替换、插入或缺失，利用 SERS，通过 DNA-DNA 杂交可实验性地突出这些突变，它们在影响基因功能、进而促进遗传多样性和疾病发展方面发挥关键作用，例如在癌症早期，仅存在痕量生物标志物，因此 SERS 作为超灵敏和非侵入性方法更受青睐，此外，基因突变的分类有助于区分不同类型的癌症。
在 DNA-DNA 杂交中采用双重检测具有重要意义，其结合了相关技术的互补属性，克服了单一检测方法的局限性，不仅提高了结果的可靠性和准确性，还能进行交叉验证和确认，减轻了个体方法的固有局限性。G-SERS 作为主要检测机制，与石英晶体微天平（QCM-D）或原子力显微镜（AFM）等双重检测的结合，为分析带来了有价值的新信息。QCM-D 有助于实时监测能力，可量化 DNA 杂交事件期间的质量变化，这种时间维度丰富了对分子相互作用动力学的理解，补充了 G-SERS 提供的分子特异性；AFM 提供纳米级分辨率，揭示 DNA 表面的地形细节，验证通过 G-SERS 获得的发现。G-SERS 与这些附加技术的协同作用不仅提高了 DNA-DNA 杂交检测的准确性和可靠性，还提供了更全面的方法，通过多方面的见解揭示分子结合事件的动态复杂性。
G-SERS 和 QCM-D 的混合设置在 DNA 检测领域开辟了新前沿，G-SERS 的分子特异性捕获 DNA 分子的振动指纹，提供其结构特征的无与伦比的见解，与 QCM-D 的同步检测不仅量化了 DNA 与基底结合后的质量变化，还评估了耗散，从而能够确定 DNA 在基底上的取向（平行、垂直或其他），进而阐明 DNA 排列如何影响 SERS 光谱，此外，量化附着在生物传感器上的 DNA 链数量可更准确地计算 SERS 增强因子，通过 QCM-D 的耗散监测还可评估各种粘弹性性质（如弹性模量），揭示单链 DNA 与互补链、错配链或其他分子杂交时这些性质的变化，这种集成方法通过提供验证和捕捉 DNA 结合动力学及相关构象和粘弹性变化的时间维度，提高了 G-SERS 的精度。例如，Liz-Marzán 小组成功整合 QCM-D 和 SERS 测量，精确研究前列腺特异性抗原，用于早期前列腺癌检测，最近的工作表明，使用 QCM-D 可优化 DNA 在石墨烯基底上的结合效率，比较不同连接剂将 DNA 附着到石墨烯表面的效果，这种整合通过确保强而可靠的 DNA 固定以及精确的质量测量，提高了传感器的灵敏度和特异性，因此，这种双重检测方法可轻松适应特定的 DNA 和 DNA-DNA 杂交检测，将 G-SERS 的特异性与 QCM-D 的时间分辨率相结合，成为以更高的准确性和深度理解 DNA 动力学复杂性的强大工具，所获得的新信息可促进相关生物医学应用的改进，如不同个性化生物传感器的设计。
G-SERS 与原子力显微镜（AFM）的集成提供了研究 DNA 检测复杂性的强大方法，这种组合方法能够同时测量 DNA 的粘弹性特性，借助 AFM 的纳米级分辨率和 G-SERS 的详细分子见解。与仅捕获附着在 QCM-D 芯片上的 DNA 链的平均粘弹性特性的 G-SERS QCM-D 集成不同，该技术还揭示了表面的形态拓扑以及纳米级的化学和机械信息，这种全面分析允许在纳米分辨率下更深入地了解 DNA 在与互补链杂交或与各种生物标志物相互作用期间的构象和刚性变化。DNA 与石墨烯之间的相互作用主要通过非共价力发生，包括 DNA 的芳香核碱基与 sp2杂化碳石墨烯之间的 π-π 堆叠，以及范德华力，这些相互作用对于生物传感器的开发至关重要，因为它们影响 DNA 在石墨烯表面的稳定性、取向和可及性，不同 DNA - 石墨烯系统的结合能可使用单分子力谱（涉及与 AFM 尖端共价连接的 DNA 链）来发现，该方法用于测量各种条件下的相互作用强度，例如，腺嘌呤与石墨烯之间的解吸力取决于温度，随着温度从 5°C 升高到 35°C，解吸力从 54 pN 到 77 pN 不等。通过使用石墨烯材料，还可在 DNA 和石墨烯材料之间创建另一种共价键，增强测量 DNA 链弹性特性的可能性，这也可与 SERS 结合。AFM 还为单分子水平的 DNA 纳米操作提供了强大平台，利用其尖锐的尖端和精确的力控制，研究人员不仅可以实时可视化 DNA 分子的地形，还可以对其进行机械操作，Wang 等人成功证明，涂有单层还原氧化石墨烯（rGO）的单个 DNA 分子可以使用 AFM 进行纳米操作，他们的工作表明，在这些 rGO 覆盖的 DNA 链上可以实现受控操作（包括切割、推动和清扫），而不会对下面的基底或 rGO 层造成损坏，这项研究强调了基于 AFM 的纳米操作技术在研究 DNA 力学和推进受益于分子相互作用高精度控制的生物传感应用方面的潜力，将 SERS 光谱与基于 AFM 的 DNA 纳米操作相结合，能够在单分子水平上同时进行机械和化学表征，从而提高生物传感器的精度，并提供对生物分子相互作用的全面见解。
G-SERS、QCM-D 和 AFM 的融合不仅是技术上的合作，也是理解 DNA 动力学的跨学科方法，随着实验系统复杂性的增加，获得良好结果的挑战也在增加，一个主要问题是实验装置的兼容性，因为每种技术都需要特定条件，例如，QCM-D 需要相对均匀的表面，而 SERS 需要纳米结构的等离子体特征，AFM 需要机械稳定和可访问的地形，此外，数据的复杂性增加（结合光谱、机械和质量相关的输出）在解释方面提出
