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为解决非天然态蛋白抑制剂筛选方法通量低、需专用仪器等问题，研究人员开展温度跳变（temperature vaulting）法筛选靶向激酶非天然态抑制剂的研究，发现该法可加速慢结合过程，助力鉴定慢 - 紧密结合抑制剂，具重要应用价值。
蛋白质的折叠过程如同一场精密的 “舞蹈”，从无序的多肽链逐步折叠成具有特定三维结构的天然态蛋白，才能发挥其生物功能。在这个过程中，往往会形成一些中间态的非天然构象。对于与疾病相关的蛋白质而言，这些非天然态的折叠中间体可能成为潜在的药物作用靶点。然而，针对非天然态蛋白的抑制剂筛选面临诸多挑战：传统方法如基于活细胞诱导表达的筛选法通量低，难以推广至其他蛋白；而生物物理测量法又依赖昂贵的专用仪器和大量纯化蛋白，成为药物发现的瓶颈。
为突破这些困境，日本信州大学（Shinshu University）的研究人员开展了相关研究，旨在开发一种高效、通用的靶向非天然态激酶的抑制剂筛选方法。他们的研究成果发表在《European Journal of Medicinal Chemistry》上，为该领域提供了新的思路和工具。
研究人员主要采用了温度控制结合激酶 assay 的技术方法。通过对重组 DYRK1A 蛋白进行短暂加热，驱动其在天然态（N）和非天然态（如折叠中间体 I）之间可逆转换，利用常规的激酶活性检测来分析抑制剂与非天然态蛋白的结合情况。
热力学驱动的构象转变与抑制剂结合特性
研究假设 DYRK1A 的折叠中间体（非天然态 I）处于 “N ? I ? U” 的热力学平衡中（N 为天然态，U 为未折叠态）。 Gibbs 自由能（G）决定了各状态的分布，而温度是调控平衡的关键因素。生理温度下，FINDY（1）与 DYRK1A 结合缓慢，但若对蛋白进行短暂加热，可帮助其克服高能垒，加速向非天然态 I 转变，从而显著加快 FINDY（1）的结合过程。同时，高能垒也使得抑制剂与蛋白解离速率（koff）降低，形成紧密结合（tight binding）。
抑制剂的选择性机制与构效关系
FINDY（1）能够选择性抑制 DYRK1A 非天然态的分子内自磷酸化（如 Ser97 位点），而不影响天然态的分子间底物磷酸化。构效关系分析表明，其甲氧基和炔基部分是实现对非天然态 DYRK1A 选择性结合的关键结构。此外，FINDY（1）对 DYRK1A 与其家族激酶 DYRK1B 的抑制选择性差异，主要由解离速率（koff）决定，这为设计高选择性抑制剂提供了依据。
温度跳变筛选法的优势与应用潜力
传统筛选方法因低通量或高成本限制了非天然态靶向药物的开发。而温度跳变（temperature vaulting）法借助温度调控蛋白构象平衡，无需复杂定制化检测，可直接利用常规激酶 assay，实现了对慢结合（slow-binding）和紧密结合抑制剂的快速鉴定。以 DYRK1A 为模型，该方法成功用于分析折叠中间体选择性抑制剂的构效关系，并加速了两步结合抑制剂的结合过程，展现了其在药物筛选中的高效性和普适性。
研究结论与意义
本研究揭示了非天然态激酶构象作为药物靶点的可行性，阐明了温度调控在蛋白 - 抑制剂相互作用中的关键作用。温度跳变筛选法为靶向非天然态蛋白的药物发现提供了一种简便、高效的新策略，有望突破传统方法的局限，推动针对具有构象动态变化的疾病相关蛋白（如激酶家族）的抑制剂开发，为开发高选择性、长作用时间的新型药物奠定了基础。该方法的通用性也为其他具有折叠中间体的蛋白质研究提供了借鉴，拓展了基于构象的药物设计思路。
