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为解决现有 BTKi 用于非肿瘤适应症时的安全性问题，研究人员对比研究新型 BTKi（包括共价不可逆 / 可逆、非共价可逆结合模式）的体外效能与选择性。发现共价 BTKi 结合具时间浓度依赖性，remibrutinib 效能最强，且 BTKi 选择性排序不同，为临床应用提供依据。
在免疫系统的复杂网络中，布鲁顿酪氨酸激酶（Bruton's tyrosine kinase，BTK）如同一个关键的信号枢纽，掌控着 B 细胞受体、FcγR（免疫球蛋白 G 的 Fc 受体）和 FcεRI（免疫球蛋白 E 的高亲和力 Fc 受体）的信号传导。它在 B 细胞、巨噬细胞、肥大细胞等免疫细胞中特异性表达，其异常激活与自身免疫性疾病（如多发性硬化症、慢性自发性荨麻疹）和过敏性疾病的发生发展紧密相连。然而，目前用于血液肿瘤治疗的 BTK 抑制剂（BTK inhibitors，BTKi），如伊布替尼，因存在靶向非肿瘤适应症时的安全性隐患，如心脏心律失常、出血、感染、肝毒性等，这些不良反应与脱靶激酶抑制相关，限制了其在自身免疫和过敏领域的应用。因此，开发具有更高选择性和安全性的新一代 BTKi 成为亟待解决的科学问题。
诺华制药公司（Novartis Pharma AG）的研究人员针对这一挑战，开展了一项系统性研究，旨在比较不同结合模式的新一代 BTKi 在体外的效能和选择性特征，相关成果发表在《European Journal of Pharmacology》。
研究采用了以下关键技术方法：
- 血液 BTK 占有率检测：通过肝素化血液与共价 BTKi 孵育，利用生物素化探针和免疫分析（MSD 平台）测定游离 BTK 和总 BTK 水平，计算 BTK 占有率及 IC50值。
- 细胞抑制实验：在人血 B 细胞和嗜碱性粒细胞中，通过流式细胞术检测 CD69 和 CD63 激活标志物，评估 BTKi 对 BTK 通路的抑制作用，并进行洗脱实验验证可逆性。
- 激酶选择性筛选：运用 KINOMEscan?平台对超 450 种人类激酶进行结合筛选，通过 KdELECT assay 测定特定激酶的解离常数（Kd），量化脱靶结合亲和力。
3.1 BTK occupancy of covalent BTKi in human blood in vitro
研究发现，共价 BTKi 在人血中的 BTK 结合呈现时间和浓度依赖性。其中，remibrutinib 的 IC50值最低（21.3 nM），表明其结合效能最强且起效最快，而 evobrutinib 的 IC50值最高（507.5 nM），效能最弱。
3.2 Inhibition of B cells and basophil activation by novel BTKi
在细胞水平，共价 BTKi 对 B 细胞和嗜碱性粒细胞的抑制效能与其 BTK 占有率高度相关。非共价可逆 BTKi fenebrutinib 虽在 B 细胞抑制中表现出与 remibrutinib 相近的 IC50值（14.6 nM），但其在嗜碱性粒细胞中的抑制效能（IC50=22.5 nM）显著优于多数共价 BTKi。
3.3 Reversibility of B cell inhibition
洗脱实验显示，fenebrutinib 在洗涤后 IC50值显著升高（从 21.5 nM 升至 276.7 nM），表明其结合可逆性强；而共价不可逆的 remibrutinib 在洗脱后 IC50值仅轻微变化，显示出持久的结合能力。
3.4 Kinase selectivity screen
激酶选择性排序为：remibrutinib > fenebrutinib > evobrutinib > orelabrutinib > rilzabrutinib > tolebrutinib。remibrutinib 对 BTK 的结合亲和力（Kd=0.63 nM）远高于脱靶激酶（如 TEC、BMX），而 rilzabrutinib 和 tolebrutinib 对 EGFR、ERBB2 等激酶显示出较强的脱靶结合，提示潜在毒性风险。
研究结论表明，新一代 BTKi 因结合模式差异，在体外效能、结合动力学和激酶选择性上表现出显著不同。remibrutinib 作为共价不可逆抑制剂，兼具高效能和高选择性，在临床前研究中展现出良好的安全性特征，为其在自身免疫和过敏疾病中的应用提供了坚实的实验依据。此外，研究揭示非共价可逆抑制剂（如 fenebrutinib）虽在生化实验中显示长滞留时间，但在细胞环境中结合易逆转，这可能与其临床需频繁给药的特点相关。该研究通过统一实验条件，首次系统比较了不同机制 BTKi 的体外特征，为临床前药物筛选和优化提供了标准化评估框架，有助于推动更安全有效的 BTKi 进入临床，造福自身免疫和过敏疾病患者。
