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为探究牡蛎血细胞增殖调控机制，研究人员以 Crassostrea gigas 为对象，分析 Cgi-miR-96P2m 在 Vibrio splendidus 刺激下的作用。发现其通过靶向 CgVEGFR，影响 MAPK 通路等，负调控增殖，为贝类免疫机制研究提供新视角。
在神秘的海洋世界里，牡蛎等贝类生物凭借独特的免疫系统在复杂环境中生存。然而，关于其血细胞增殖调控机制，尤其是微小 RNA（microRNA，miRNA）在此过程中的作用，仍有许多未解之谜。免疫细胞增殖的精准调控对维持免疫系统功能至关重要，无脊椎动物的血细胞如同脊椎动物的白细胞，承担着免疫稳态维持等重要任务。在病原体挑战时，血细胞的持续补充和增殖尤为关键，但目前对于其复杂调控系统的认知尚不全面。miRNA 作为一类重要的内源性非编码 RNA，通过介导 mRNA 切割或翻译抑制来调控基因表达，在细胞增殖、信号通路调控等方面发挥着关键作用。尽管在哺乳动物和其他一些无脊椎动物中已有部分 miRNA 调控血细胞增殖的研究，但在牡蛎这类重要的经济贝类中，相关分子机制仍知之甚少。
为了揭开牡蛎血细胞增殖调控的神秘面纱，大连海洋大学的研究人员开展了关于 Cgi-miR-96P2m 在牡蛎免疫应答中调控血细胞增殖机制的研究。该研究成果发表在《Fish》杂志上，为深入理解牡蛎免疫机制提供了重要依据。
研究人员主要采用了以下关键技术方法：首先进行了序列比对分析，以探究 Cgi-miR-96P2m 的序列保守性；通过 EdU 细胞增殖检测，观察血细胞的增殖情况；运用双荧光素酶报告基因实验，验证 Cgi-miR-96P2m 与靶基因 CgVEGFR 的结合活性；利用 KEGG 富集分析，确定靶基因富集的信号通路；还通过基因表达分析，检测相关基因的表达变化。实验所用的两年生牡蛎（壳长 12-16 cm）取自大连当地养殖场，Vibrio splendidus 在 2216E 液体培养基中于 16°C 培养 24 小时后，用无菌海水重悬至最终浓度 2×108 CFU/mL 用于刺激实验。
序列保守性和表达模式
序列比对分析显示，Cgi-miR-96P2m 与其他物种的 miR-96 具有高度保守性。在脊椎动物如人类（Homo sapiens）、豚鼠（Cavia porcellus）和文昌鱼（Branchiostoma lanceolatum）中，其种子区域完全相同；在软体动物中，种子区域也完全一致。进一步研究发现，在 Vibrio splendidus 刺激后 48 小时，牡蛎血细胞中 Cgi-miR-96P2m 的表达水平显著下调。
对血细胞增殖的影响
通过 EdU 细胞增殖检测发现，与抑制剂阴性对照（inhibitor NC）+Vs 组相比，Cgi-miR-96P2m 抑制剂 + Vs 组中 EdU+细胞的百分比显著升高；而与模拟物阴性对照（mimics NC）+Vs 组相比，Cgi-miR-96P2m 模拟物 + Vs 组中 EdU+细胞的百分比显著降低。这表明 Cgi-miR-96P2m 对牡蛎血细胞增殖具有负调控作用。
靶基因验证及信号通路分析
预测显示 Cgi-miR-96P2m 在 CgVEGFR 的编码序列区域 2383-2401 bp 处存在结合位点，双荧光素酶报告基因实验进一步证实了其与 CgVEGFR mRNA 的结合活性。KEGG 富集分析表明，Cgi-miR-96P2m 的靶基因在 MAPK 信号通路和凋亡过程中富集。抑制 Cgi-miR-96P2m 可导致 CgP38、细胞周期相关基因（CgCDK2、CgCDC45）、转录因子（CgGATA、CgRunx）以及凋亡相关基因如 CgBCL-2 的表达上调。
综上所述，本研究表明 Cgi-miR-96P2m 在牡蛎应对 Vibrio splendidus 刺激的免疫应答中，通过靶向 CgVEGFR 并影响细胞周期和凋亡相关基因的表达，负调控血细胞增殖。该研究不仅揭示了牡蛎血细胞增殖调控的新机制，为深入理解无脊椎动物免疫应答的分子机制提供了重要线索，也为寻找贝类免疫相关生物标志物和开发新型免疫调控策略奠定了基础。同时，研究结果也突显了 miRNA 在无脊椎动物免疫稳态维持中的重要作用，为跨物种保守 miRNA 的功能研究提供了新的视角。
