屎肠球菌新菌株质粒的分离及其作为穿梭克隆载体的构建研究

为构建穿梭克隆载体，研究人员对屎肠球菌（Enterococcus faecium）质粒 pRGK7d 开展分子表征研究。通过克隆至 pUC18 和 T 载体并引入 ampr和 eryr标记，成功构建穿梭载体，其在宿主中稳定且赋予抗性，为相关研究提供工具。

　　肠球菌是人类胃肠道的天然定植菌，其携带的质粒常被用于构建质粒载体。从新生儿粪便中分离的屎肠球菌（Enterococcus faecium）菌株 RGK7 天然含有一个 1935 bp 的质粒 pRGK7d。本研究聚焦于该质粒的分子表征及其在穿梭克隆载体构建中的应用。通过表型、基因型方法（包括 16S rRNA 测序）鉴定菌株 RGK7 为屎肠球菌，系统发育分析也证实该菌株属于屎肠球菌类群。对 pRGK7d 质粒序列的 BLAST 分析显示，其与屎肠球菌复制蛋白基因同源性最高。ORF Finder 分析表明，1.9 kb 的质粒 pRGK7d 在多个重叠阅读框中共有 17 个 ORF，其中最大的 ORF 序列与屎肠球菌 Rep 蛋白具有 97% 的同源性。为使其成为大肠杆菌 - 肠球菌穿梭载体，首先将该质粒克隆至 pUC18，然后通过引入氨苄青霉素抗性（amp^r）和红霉素抗性（ery^r）标记（分别用于革兰氏阴性大肠杆菌和革兰氏阳性屎肠球菌的筛选），再克隆至 T 载体。通过仅克隆 Rep 蛋白而非整个质粒与 ery^r基因，使穿梭载体体积减小且更有效。结论显示，利用质粒 pRGK7d 构建的大肠杆菌 - 肠球菌穿梭载体在转化后，分别赋予原本敏感的大肠杆菌和肠球菌氨苄青霉素和红霉素抗性，且该穿梭载体在两种菌体中均稳定。