YBX1 通过 m5C 依赖方式调控颗粒细胞周期及其在原发性卵巢功能不全中的作用机制研究

为探究 YBX1 在原发性卵巢功能不全（POI）中是否通过 m5C 依赖方式发挥作用，研究人员对人颗粒细胞（GCs）展开研究。发现 bPOI 患者 GCs 中 YBX1 表达下调，其敲低会阻滞细胞周期 G1/S 期转换，揭示了 YBX1/m5C 调控 POI 的新机制。

　　在女性生殖健康领域，卵巢功能的正常维持至关重要。原发性卵巢功能不全（Primary Ovarian Insufficiency, POI）作为一种严重影响育龄女性生育能力的疾病，其特征为 40 岁前月经停止、血清卵泡刺激素（FSH）升高、雌二醇降低及雌激素缺乏症状，患病率达 2-4%。尽管已知遗传、免疫、感染等因素与 POI 相关，但因其高度异质性，临床防治仍面临挑战。近年来，RNA 修饰作为表观遗传学的重要组成部分，在卵巢发育和疾病中的作用逐渐受到关注，尤其是 N⁶- 甲基腺苷（m⁶A）修饰已有较多研究，但 5 - 甲基胞嘧啶（m⁵C）修饰在 POI 中的作用尚不清楚。Y-box 结合蛋白 1（YBX1）作为已知的 m⁵C “读者” 蛋白，已有研究表明其通过与长链非编码 RNA 结合参与 POI 患者颗粒细胞（Granulosa Cells, GCs）功能异常，但 YBX1 是否通过 m⁵C 依赖方式参与 POI 发病仍不明确。

为解决这一科学问题，浙江大学医学院附属妇产科医院的研究人员开展了相关研究。他们发现，在生化性 POI（bPOI）患者的颗粒细胞中，YBX1 的转录和蛋白表达水平显著降低，且其表达与血清抗苗勒管激素（AMH）呈正相关，与 FSH 呈负相关，还与试管婴儿（IVF）的获卵数和受精卵数正相关。进一步通过细胞实验证实，在人颗粒细胞系 KGN 中敲低 YBX1 会抑制细胞增殖，阻滞细胞周期于 G1 期，减少 S 期细胞比例，同时降低细胞周期调控蛋白 CDK4、CDK6 和 Cyclin D1 的表达；而过表达 YBX1 则促进细胞增殖。机制研究表明，YBX1 通过识别 m⁵C 修饰，稳定细胞周期相关基因如 CCND1、CCNE1 和 RCC1 的 mRNA，从而调控颗粒细胞周期进程。该研究成果发表在《Cellular and Molecular Life Sciences》，为 POI 的发病机制提供了新视角。

研究主要采用了以下关键技术方法：一是样本采集，纳入 40 例 bPOI 患者和 47 例对照，采集血液检测激素水平，获取卵泡液分离颗粒细胞；二是分子生物学技术，包括实时定量 PCR（qRT-PCR）检测基因表达，蛋白质免疫印迹（Western blot）分析蛋白水平，RNA 免疫沉淀（RIP）验证 YBX1 与靶 RNA 的结合，甲基化 RNA 免疫沉淀（MeRIP）检测 m⁵C 修饰水平；三是细胞功能实验，如细胞计数试剂盒 - 8（CCK-8）和 EdU 实验检测细胞增殖，流式细胞术分析细胞周期；四是高通量测序，包括转录组测序（RNA-seq）和 m⁵C 甲基化组测序（MeRIP-seq），结合生物信息学分析筛选差异基因和修饰位点；五是荧光素酶报告基因实验验证 YBX1 与靶基因 5' 非翻译区（5'UTR）m⁵C 修饰的相互作用。

YBX1 在 bPOI 患者颗粒细胞中表达下调

通过 qRT-PCR 和 Western blot 检测发现，bPOI 患者颗粒细胞中 YBX1 的 mRNA 和蛋白表达均显著低于对照组。相关性分析显示，YBX1 mRNA 水平与血清 AMH 呈正相关，与 FSH 呈负相关，且与 IVF 治疗中的获卵数和受精卵数正相关，提示 YBX1 可能参与 POI 的发生发展。

YBX1 调控颗粒细胞增殖和细胞周期

在 KGN 细胞中敲低 YBX1 后，CCK-8 和 EdU 实验显示细胞增殖能力显著下降，流式细胞术表明 G0/G1 期细胞比例增加，S 期细胞减少，同时 CDK4、CDK6 和 Cyclin D1 等 G1/S 期关键蛋白表达降低。而过表达 YBX1 则促进细胞增殖，增加 S 期细胞比例，上调细胞周期蛋白表达，证实 YBX1 对颗粒细胞周期进程的调控作用。

YBX1 敲低改变颗粒细胞的转录组和 m⁵C 甲基化组

RNA-seq 分析发现，YBX1 敲低后，差异表达基因主要富集在细胞周期、DNA 复制等通路，细胞周期相关基因如 CCND1、CCNE1、RCC1 等表达下调。MeRIP-seq 显示，YBX1 敲低导致 m⁵C 甲基化位点显著改变，其中 211 个下调基因同时存在 m⁵C 低甲基化，且这些基因富集于细胞周期和 G1/S 期转换通路。结合已有的 YBX1 结合靶点数据，筛选出 CCND1、CCNE1、RCC1 等作为 YBX1 的潜在靶基因，RIP-qPCR 验证了 YBX1 与这些基因的结合。

YBX1 通过 m⁵C 依赖方式稳定靶基因 mRNA

MeRIP-qPCR 证实 CCND1、CCNE1、RCC1 的 mRNA 存在 m⁵C 修饰，且 YBX1 敲低后其 m⁵C 富集水平降低。RNA 稳定性实验显示，YBX1 敲低缩短了这些基因的 mRNA 半衰期。荧光素酶报告基因实验表明，YBX1 通过识别 CCND1 5'UTR 的 m⁵C 修饰位点来稳定其 mRNA，突变该位点后，YBX1 的稳定作用消失。

研究结论表明，YBX1 在 bPOI 患者颗粒细胞中表达下调，其通过识别 m⁵C 修饰，稳定 CCND1、CCNE1、RCC1 等细胞周期相关基因的 mRNA，调控 G1/S 期转换，从而影响颗粒细胞增殖。该研究首次揭示了 YBX1/m⁵C 通路在 POI 中的作用机制，为 POI 的病理机制提供了新的分子解释，有望为 POI 的诊断和治疗提供潜在靶点。尽管研究基于细胞系模型，其在体内的作用仍需进一步动物实验验证，但该发现为理解 POI 的表观遗传调控网络拓展了新方向，为探索 RNA 修饰相关治疗策略奠定了基础。