mlstverse-web与NALC-Seq技术：基于靶向捕获测序的痰液分枝杆菌实时鉴定新策略

为解决分枝杆菌（包括结核分枝杆菌MTB和非结核分枝杆菌NTM）鉴定耗时长、传统方法（如PCR和质谱）物种覆盖度不足的问题，研究人员开发了整合靶向捕获测序（NALC-Seq）与实时分析系统mlstverse-web的新方法。该技术通过RNA探针富集痰液样本中的分枝杆菌DNA，结合MinION测序设备，将鉴定时间从686小时缩短至19小时，灵敏度达98.1%，可检测罕见及耐药亚种，为临床诊断和公共卫生监测提供快速精准的解决方案。

　　

分枝杆菌感染是全球公共卫生的重大挑战，尤其是结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, MTB）和非结核分枝杆菌（Non-tuberculous mycobacteria, NTM）。这些病原体不仅致病性强，且耐药性问题日益严峻。传统诊断方法如PCR和质谱技术存在明显局限：PCR仅能覆盖有限物种，而质谱需依赖耗时长达8周的细菌培养。尽管二代测序（NGS）能实现亚种水平鉴定，但仍受限于培养周期。因此，开发一种无需培养、快速且全面的分枝杆菌鉴定技术成为迫切需求。

为突破这一瓶颈，大阪大学等机构的研究团队开发了名为NALC-Seq的创新方法，结合靶向捕获测序与实时分析系统mlstverse-web，直接从痰液样本中鉴定分枝杆菌。该研究发表于《Functional Genomics》，通过前瞻性和回顾性纳入54例患者样本，证明该方法灵敏度达98.1%，平均鉴定时间缩短至19小时，显著优于传统方法的686小时。

研究团队采用多项关键技术：

1. 靶向捕获测序（NALC-Seq）：设计特异性RNA探针富集分枝杆菌DNA，覆盖186种分枝杆菌的MLST位点。
2. 实时分析系统mlstverse-web：整合Web、Upload、Head和Cloud节点，实现MinION测序数据的自动上传与云端分析。
3. 耐药性预测：通过分析rrs、rrl和erm(41)基因突变，评估克拉霉素和阿米卡星等关键药物的耐药性。

研究结果

痰液宏基因组中分枝杆菌的存在

通过宏基因组测序发现，痰液中分枝杆菌DNA占比仅0.1%-34%，传统测序难以检测。靶向富集后，即使仅1 pg目标DNA（相当于2.9×10⁵ cells/mL），仍能实现100%的MLST评分，灵敏度显著提升。

NALC-Seq的全面鉴定能力

在54例样本中，NALC-Seq与培养结果一致性达83.3%，成功鉴定罕见物种如脓肿分枝杆菌亚种（M. abscessus subsp. massiliense）和缓慢分枝杆菌（M. lentiflavum）。9例差异样本中，低涂片阳性率提示环境分枝杆菌污染可能。

实时鉴定与临床验证

MinION设备结合mlstverse-web系统，在测序启动2小时内即可获得结果。样本#54（M. avium subsp. hominissuis）的MLST评分在30分钟内稳定，全程仅19小时。耐药预测与表型测试一致性较高，但低生物量样本可能出现假阳性。

结论与意义

NALC-Seq通过靶向富集和实时分析，解决了传统方法耗时长、覆盖窄的痛点，尤其适用于耐药菌株和罕见NTM的快速鉴定。mlstverse-web系统无需生物信息学专长，便于临床推广。未来需扩大样本量并优化成本，但其技术框架为其他病原体诊断提供了重要参考，推动感染性疾病诊疗进入“精准快”时代。

（注：全文细节均基于原文，专业术语如MLST^*（多位点序列分型）首次出现时已标注，作者名保留原格式如Yuki Matsumoto。）