乳腺癌肿瘤内空间异质性的高维蛋白质多重分析与单细胞表型定量研究

为探究乳腺癌肿瘤内异质性对诊断及治疗的影响，研究人员利用定量多重免疫荧光（MxIF）成像等技术，分析 38 例多灶性乳腺癌的生物标志物表达及免疫细胞空间分布。发现 34.2% 病例存在多分子亚型，多数癌种生物标志物表达异质性高，HER2 表达与基因及临床评分相关性差，为预后和治疗提供新视角。

　　

乳腺癌作为全球女性最常见的恶性肿瘤之一，其复杂的异质性一直是精准诊疗的巨大挑战。传统病理诊断依赖单一组织样本的免疫组化（IHC）评分，难以捕捉肿瘤内部不同区域在生物标志物表达、细胞组成及空间分布上的差异。例如，临床常用的 HER2 评分基于整体染色强度，而肿瘤内可能存在局部高表达或低表达区域，导致治疗决策偏差。此外，肿瘤微环境中免疫细胞的空间分布与治疗响应密切相关，但传统方法无法精细解析这些空间特征。因此，深入解析乳腺癌的肿瘤内异质性（Intra-tumoral Heterogeneity, ITH），尤其是空间维度的异质性，对优化诊断和治疗策略至关重要。

加拿大 Sunnybrook 健康科学中心的研究团队在《Breast Cancer Research》发表的研究，针对多灶性乳腺癌的肿瘤内异质性展开系统研究。研究通过分析肿瘤不同区域的生物标志物表达、分子亚型分布及免疫微环境特征，揭示了 ITH 在乳腺癌中的广泛存在及其对临床实践的潜在影响。

关键技术方法

1. 全 mount 组织病理技术：对 61 例乳腺癌保乳手术标本进行全组织切片，获取多区域样本，构建组织微阵列（TMA），确保覆盖肿瘤不同病灶。
2. 多重免疫荧光（MxIF）成像：使用 GE Research 的 MxIF 平台和 Leica Cell DIVE 系统，对 ER、PR、HER2、Ki67 等生物标志物及 CD3、CD8 等免疫细胞标志物进行单细胞定量分析。
3. 分子亚型分析：通过 NanoString BC360 检测 PAM50 分子亚型，将肿瘤分为 Luminal A、Luminal B、HER2-enriched 和 Basal-like 亚型。
4. 空间免疫表型分析：将组织图像分割为 48.75 μm×48.75 μm 的微斑块，基于免疫细胞组成进行无监督聚类，定义不同免疫微环境表型。

研究结果

1. 多灶性乳腺癌的分子亚型异质性

• 38 例患者中，34.2%（13 例）存在肿瘤内分子亚型多样性（Polytypic），同一肿瘤不同区域可同时存在 Luminal A、Luminal B 或 Basal-like 等多种亚型。
• 单分子亚型病例中，Luminal A 占 26.3%，Basal-like 占 15.8%，HER2-enriched 仅 5.3%，提示分子亚型在肿瘤内的分布具有显著异质性。

2. 生物标志物表达的肿瘤内异质性

• ER/PR 表达：Luminal A 型肿瘤的 ER 和 PR 组织评分（H-score）在不同区域差异显著，部分病例的 ER 评分波动超过 100 分，显示激素受体表达的空间不均一性。
• Ki67 阳性率：Polytypic 肿瘤的 Ki67 阳性细胞比例差异较大，与 Luminal B 型相比，Polytypic 肿瘤的增殖活性异质性更高。
• HER2 表达：MxIF 检测的 HER2 蛋白水平与 mRNA 表达（Pearson R=0.59）及临床 IHC 评分相关性较弱，尤其在 HER2 IHC 1 + 和 2 + 病例中，蛋白表达异质性显著，提示传统 IHC 评分可能低估肿瘤内 HER2 的真实分布。

3. 单细胞聚类揭示细胞组成异质性

• 基于 ER、PR、HER2、Ki67 和 CK8/18 的无监督聚类（PhenoGraph，K=18）识别出 18 种细胞簇，其中 K1-K4 和 K18 簇富集高 ER 表达细胞，K12-K15 簇为低 ER 表达细胞，显示肿瘤细胞在激素受体状态和增殖活性上的多样性。
• Luminal A 型肿瘤的细胞簇组成异质性更高，提示其内部细胞谱系更为复杂。

4. 免疫微环境的空间异质性

• 通过微斑块分析定义 8 种免疫表型，包括 “免疫冷” 表型（如仅含癌细胞）和 “免疫热” 表型（如 CD3 富集、CD68 富集）。
• Luminal A 型肿瘤的 CD3 富集表型比例显著高于 Luminal B 型（p=0.036），而 Basal-like 型未显示显著免疫特征，可能与样本量小或取样区域偏倚有关。

结论与讨论

本研究通过高维蛋白质组和单细胞空间分析，系统性揭示了乳腺癌的肿瘤内异质性，主要结论包括：

1. 分子亚型异质性普遍存在：约 1/3 的多灶性乳腺癌存在肿瘤内分子亚型多样性，提示临床诊断需避免依赖单一区域活检，尤其是对较大肿瘤或多灶性病变应增加采样量。
2. 生物标志物表达异质性影响治疗决策：HER2 蛋白表达与基因水平及临床评分的低相关性，可能解释部分 HER2-low 肿瘤对靶向治疗的响应差异，需结合单细胞定量技术优化 HER2 检测。
3. 免疫微环境的空间特征与亚型相关：Luminal A 型肿瘤的免疫微环境更具多样性，可能与其对内分泌治疗和免疫治疗的复杂响应有关，为联合治疗策略提供依据。

研究的临床意义在于：

• 强调全组织病理评估（如 Whole-mount 技术）在捕捉肿瘤异质性中的重要性，建议对高级别或多灶性肿瘤采用更全面的样本分析。
• 推动单细胞空间技术（如 MxIF）在病理诊断中的应用，以补充传统 IHC 的不足，尤其是在 HER2 状态评估和免疫治疗生物标志物探索中。
• 提示肿瘤异质性可能是治疗耐药和复发的根源，未来需开发针对异质性的联合疗法，如多靶点药物或免疫 - 内分泌联合治疗。

该研究为乳腺癌的精准诊疗提供了新的理论基础，但其局限性在于样本量较小，且免疫微环境分析集中于癌巢区域，可能遗漏基质中的免疫结构（如三级淋巴滤泡）。未来需结合空间转录组和更大样本队列，进一步解析异质性的分子驱动机制和临床预后价值。