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为解决小分子抗癌药缺乏细胞选择性的问题，研究人员设计 AS1411 适配体与吉西他滨（Gemcitabine）的偶联物，引入谷胱甘肽（GSH）敏感的二硫键 linker。结果显示该偶联物在肿瘤细胞中高效释放药物，显著提升对 A549 细胞的杀伤选择性，为靶向治疗提供新策略。
癌症治疗中，小分子化疗药物如吉西他滨（Gemcitabine）虽广泛应用，但因无法精准区分癌细胞与正常细胞，常导致严重毒副作用和治疗指数低下。如何实现药物的肿瘤细胞选择性递送与释放，成为提升疗效、降低毒性的关键科学问题。在此背景下，日本京都大学（Graduate School of Pharmaceutical Science, Kyoto University）与中国沈阳药科大学（Wuya College of Innovation, Shenyang Pharmaceutical University）的研究团队合作，开展了适配体 - 药物偶联物的肿瘤靶向递送研究，相关成果发表于《The AAPS Journal》。
研究人员围绕 “如何通过智能响应型 linker 实现药物在肿瘤细胞内的精准释放” 这一核心问题，设计了以 AS1411 适配体为靶向载体、吉西他滨为模型药物、二硫键为还原敏感型 linker 的偶联物（AS1411-S-S-Gem）。AS1411 是一种能特异性结合肿瘤细胞表面高表达核仁素（nucleolin）的 DNA 适配体，而二硫键可在肿瘤细胞内高浓度谷胱甘肽（GSH，6-10 mM）环境中快速断裂，释放药物。
研究采用的关键技术方法包括：① 偶联物合成：通过马来酰亚胺基团将 AS1411 适配体与吉西他滨通过二硫键或非 cleavable 碳碳键连接，制备 AS1411-S-S-Gem、AS1411-Gem 及对照偶联物 cAS1411-S-S-Gem；② 药物释放分析：利用高效液相色谱（HPLC）检测偶联物在不同浓度 GSH 中的吉西他滨释放效率；③ 细胞毒性评估：通过 WST-8 法测定偶联物对肺癌细胞 A549、正常乳腺细胞 MCF10A 及宫颈癌细胞 HeLa 的增殖抑制能力；④ 结构表征：采用圆二色谱（CD spectroscopy）验证适配体偶联物的 G - 四链体结构稳定性。
结果与结论
1. 偶联物结构与 G - 四链体稳定性
CD 光谱显示，AS1411-S-S-Gem 和 AS1411-Gem 均保留了与 AS1411 一致的 G - 四链体特征峰（262 nm 和 209 nm 正峰，240 nm 负峰），表明偶联过程未破坏适配体的空间结构；而对照序列 cAS1411-S-S-Gem 因缺乏 G - 四链体形成能力，光谱特征显著不同。这证实 AS1411 适配体在偶联后仍能维持与核仁素结合的结构基础。
2. 二硫键的还原响应性释放行为
HPLC 结果显示，在模拟肿瘤细胞内环境的 6 mM GSH 中，AS1411-S-S-Gem 于 30 分钟内释放几乎全部吉西他滨，且偶联物保留时间从 10.6 min 缩短至 9.4 min，提示二硫键断裂导致分子量减小；而无硫键的 AS1411-Gem 在相同条件下仅释放 4% 的药物，证实二硫键的还原敏感性是药物释放的关键机制。在模拟血浆的 1 μM GSH 中，两种偶联物均无显著药物释放，表明体系在循环中具有稳定性。
3. 肿瘤细胞选择性细胞毒性
细胞毒性实验表明，AS1411-S-S-Gem 对 A549 细胞的杀伤能力显著高于对照偶联物：在 100 nM 浓度下，其细胞存活率仅为 40%，而缺乏适配体的 cAS1411-S-S-Gem 和无硫键的 AS1411-Gem 存活率分别为 65% 和 55%。与正常细胞 MCF10A 相比，AS1411-S-S-Gem 在 A549 中的毒性差异倍数达 2.5 倍，而游离吉西他滨对两种细胞毒性无显著差异，凸显了偶联物的肿瘤选择性。在 HeLa 细胞中也观察到类似趋势，进一步验证了适配体 - 硫键体系的普适性。
4. 作用机制与选择性来源
研究证实，AS1411-S-S-Gem 的选择性源于双重机制：① 适配体 AS1411 与肿瘤细胞表面核仁素的特异性结合，促进偶联物内化；② 肿瘤细胞内高浓度 GSH 触发二硫键断裂，释放药物。对照实验显示，缺乏适配体的 cAS1411-S-S-Gem 因无法结合核仁素，导致非特异性摄取增加且药物释放效率低下，其对 A549 与 MCF10A 的毒性差异仅为 1.3 倍，印证了适配体靶向的必要性。
讨论与意义
该研究通过 “适配体靶向 + 还原响应释放” 的双重策略，成功构建了兼具精准递送与智能释放特性的药物偶联物体系。与传统化疗相比，AS1411-S-S-Gem 在维持药物抗肿瘤活性的同时，显著降低了对正常细胞的毒性，为解决小分子药物的选择性难题提供了新范式。尽管偶联物因分子量较大导致对肿瘤细胞的绝对杀伤效率略低于游离药物，但其在体内可能通过减少非特异性分布、延长肿瘤滞留时间等优势弥补这一不足。此外，该研究中采用的二硫键 linker 设计思路可推广至其他适配体 - 药物组合，为开发基于肿瘤微环境响应的智能递送系统奠定了基础。
综上所述，该工作不仅深化了对适配体 - 药物偶联物作用机制的理解，更展示了还原敏感型 linker 在肿瘤靶向治疗中的巨大潜力，为下一代精准化疗药物的研发提供了重要理论与实验依据。
