综述：工程化细胞外囊泡：突破精子冷冻保存挑战的新方法

这篇综述系统阐述了细胞外囊泡(EVs)在修复精子冷冻损伤中的突破性应用，重点探讨了EVs携带的蛋白质、miRNAs等生物活性分子通过能量供给、膜修复、抗氧化等机制提升冻融精子活力与生育力，并创新性提出直接/间接EV工程化策略（如电穿孔、声波处理）定制治疗性内容物，为辅助生殖技术(ART)提供了新思路。

　　

背景

人工授精(AI)在人类不孕症治疗和野生动物保护中至关重要，但精子冷冻保存导致的质膜损伤、DNA断裂和线粒体功能障碍严重制约其成功率。冷冻过程引发的氧化应激、渗透压变化和温度波动会破坏精子结构，包括质膜完整性、顶体结构、核蛋白修饰及关键mRNAs降解，最终导致受精能力和胚胎发育潜力下降。传统冷冻保护剂（如甘油）虽能部分缓解损伤，但高浓度毒性限制了其效果。

细胞外囊泡的生物特性

EVs是直径30-5000 nm的膜性囊泡，根据来源分为外泌体(<100 nm)、微囊泡(100-1000 nm)和凋亡小体(>500 nm)。它们通过表面受体结合、膜融合或内吞作用将蛋白质（如热休克蛋白HSPA5）、脂质和核酸（如miR-486-5p）递送至靶细胞。在男性生殖系统中，支持细胞(SC-EXO)、附睾(附睾小体)和前列腺(前列腺小体)分泌的EVs通过调控精子发生、成熟和获能等过程发挥关键作用。

EVs修复冷冻精子的机制

生物能量供给：前列腺小体通过产生ATP增强精子活力，间充质干细胞(MSC)来源的EVs可修复冻融精子线粒体膜电位，维持ATP合成酶活性。
膜结构修复：附睾小体携带的胆固醇和鞘磷脂能稳定精子膜流动性，犬科动物输卵管小体(oviductosomes)可防止顶体提前释放。
miRNA调控：猪精浆EVs中的miR-222通过抑制BCL2L11减少精子凋亡，而小鼠输卵管小体递送的miR-34c-5p能调控胚胎中心体功能。
抗氧化保护：MSC-EVs富含超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)，可中和冷冻过程中积累的活性氧(ROS)。

EV工程化策略

间接改造：通过基因编辑（如过表达NSMase2增加miRNA分泌）或母细胞孵育（如加载miR-22增强ATP合成）定制EV内容物。
直接加载：电穿孔法高效导入治疗性miRNAs（效率优于超声处理），皂苷透化法可嵌入膜稳定蛋白（如附睾蛋白P34H）。最佳细胞来源包括自体间充质干细胞（避免免疫排斥）和精浆EVs（天然生殖微环境）。

挑战与展望

EVs的异质性、规模化生产瓶颈和存储稳定性仍是临床转化障碍。3D培养技术和生物反应器可提升产量，而遵循ISEV的MISEV指南能确保质量控制。伦理方面需优先选择自体来源，避免生殖系基因修饰风险。未来研究可探索EVs联合纳米脂质体（如大豆卵磷脂）的协同效应，或应用于卵母细胞冷冻保护领域。

该综述为生殖医学提供了从分子机制到临床应用的完整视角，标志着精子冷冻技术从传统冷冻保护剂时代迈向精准EV疗法的转折点。