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【编辑推荐】为探究辐射诱导肺纤维化（RIPF）机制，研究人员以小鼠和大鼠为模型，聚焦 TRIB3 蛋白展开研究。发现 TRIB3 在肺泡 Ⅱ 型上皮细胞（AECⅡ）中高表达，通过抑制自噬通量促进外泌体分泌，激活成纤维细胞。该研究为 RIPF 治疗提供新靶点。
辐射诱导肺纤维化机制研究：TRIB3 蛋白的关键作用与调控网络
一、研究背景与科学问题
肺部纤维化是放疗后常见的严重并发症，辐射诱导肺纤维化（Radiation-induced Pulmonary Fibrosis, RIPF）会导致肺功能不可逆损伤，严重影响患者生存质量。目前，RIPF 的发病机制尚未完全阐明，缺乏有效的治疗手段。已有研究表明，肺泡 Ⅱ 型上皮细胞（Alveolar Epithelial Type Ⅱ Cells, AECⅡ）的损伤和成纤维细胞的异常活化是肺纤维化的核心环节，而细胞间信号传递和自噬功能异常在其中扮演重要角色。TRIB3 蛋白作为一种假激酶，此前被报道与多种纤维化疾病相关，但其在 RIPF 中的具体作用及分子机制仍不明确。因此，揭示 TRIB3 在 RIPF 中的功能及其调控通路，对于寻找新的治疗靶点具有重要科学意义和临床价值。
为解答上述问题，国内研究团队围绕 TRIB3 蛋白展开系统研究，相关成果发表于《Respiratory Research》。
二、主要研究方法与技术
研究团队采用大鼠和小鼠 RIPF 模型，通过以下关键技术开展研究：
- 动物模型构建：对大鼠和小鼠单侧右肺进行 17 Gy X 射线照射，分别在照射后 4 个月（大鼠）和 6 个月（小鼠）诱导出 RIPF 模型，并通过 H&E 染色和 Masson 三色染色验证肺纤维化程度。
- 分子生物学技术：利用 RNA 测序（RNA-seq）分析 RIPF 模型与正常肺组织的转录组差异，结合 RT-PCR 和 Western blot 验证基因表达；通过流式细胞术检测细胞表面标志物共表达情况。
- 细胞功能实验：采用 EdU 增殖实验、Transwell 迁移实验检测成纤维细胞（NIH/3T3）的增殖和迁移能力；通过差速离心分离外泌体，结合纳米颗粒跟踪分析（NTA）和免疫荧光染色鉴定外泌体分泌水平。
- 自噬通量检测：利用 mRFP-GFP-LC3 融合蛋白荧光标记技术，通过荧光显微镜观察自噬体与溶酶体的融合情况，评估自噬通量变化。
- 蛋白互作研究：运用免疫共沉淀（Co-IP）技术验证 TRIB3 与自噬受体蛋白 SQSTM1 的相互作用。
三、研究结果与核心发现
（一）TRIB3 在 RIPF 模型中显著高表达
通过 RNA 测序和后续验证实验发现，RIPF 大鼠和小鼠肺组织中 TRIB3 mRNA 和蛋白水平均显著上调，且 TRIB3 主要富集于 AECⅡ 细胞。单细胞 RNA 测序分析公共数据集 GSE211713 进一步证实，TRIB3 在辐射损伤后的 AECⅡ 集群中特异性表达升高。免疫荧光染色和流式细胞术显示，TRIB3 与 AECⅡ 特异性标志物 SPC（肺表面活性物质相关蛋白 C）共表达，且在 X 射线照射后的 MLE12 细胞（小鼠 AECⅡ 细胞系）中 TRIB3 蛋白水平显著增加。
（二）TRIB3 沉默减轻小鼠肺纤维化程度
利用腺相关病毒（AAV6）介导的 AECⅡ 特异性 TRIB3 基因敲除模型，研究发现敲低 TRIB3 可显著降低 RIPF 小鼠肺组织中 TRIB3 蛋白水平，减少羟脯氨酸含量和胶原沉积（Masson 染色证实），减轻细胞外基质增生和肺结构破坏。此外，TRIB3 敲除还抑制了成纤维细胞活化标志物（如 FN1、MMP2、α-SMA）的表达，表明 TRIB3 在 AECⅡ 中的高表达是驱动肺纤维化的关键因素。
（三）TRIB3 通过促进外泌体分泌介导 AECⅡ 与成纤维细胞的交互作用
条件培养基（CM）实验表明，TRIB3 过表达的 MLE12 细胞培养上清可显著增强 NIH/3T3 细胞的增殖和迁移能力，且该效应可通过去除外泌体消除。进一步研究发现，TRIB3 过表达的 AECⅡ 细胞外泌体分泌量显著增加，纳米颗粒跟踪分析显示外泌体浓度与 TRIB3 表达呈正相关。转录组相关性分析显示，TRIB3 表达与外泌体标志物 TSG101、CD9、CD63 呈显著正相关，证实 TRIB3 通过促进外泌体分泌激活成纤维细胞。
（四）TRIB3 通过抑制自噬通量促进外泌体分泌
机制研究发现，RIPF 肺组织中自噬通量受损，表现为自噬受体蛋白 SQSTM1 聚集增加，溶酶体功能异常。TRIB3 过表达可进一步加剧 SQSTM1 聚集，而 TRIB3 敲除则减少其聚集。利用 mRFP-GFP-LC3 荧光标记系统观察到，TRIB3 过表达导致 GFP/mRFP 信号比值升高，提示自噬体与溶酶体融合受阻，自噬通量被抑制；反之，TRIB3 敲除促进自噬溶酶体形成。此外，抑制自噬通量的药物羟氯喹（HCQ）可逆转 TRIB3 敲除导致的外泌体分泌减少，证实 TRIB3 通过抑制自噬通量增强外泌体释放。
（五）TRIB3 与 SQSTM1 直接互作调控自噬通量
免疫共沉淀和免疫荧光共定位实验证实，TRIB3 与 SQSTM1 在肺组织和 MLE12 细胞中存在直接相互作用。截断突变实验表明，TRIB3 通过其特定结构域与 SQSTM1 的泛素结合结构域结合，阻碍 SQSTM1 介导的自噬降解过程，从而抑制自噬通量。过表达 SQSTM1 可逆转 TRIB3 敲除对自噬通量和外泌体分泌的影响，进一步验证了两者的调控关系。
四、研究结论与科学意义
本研究首次揭示 TRIB3 在 RIPF 中通过抑制 AECⅡ 自噬通量、促进外泌体分泌，进而激活成纤维细胞的分子机制。具体而言，TRIB3 通过与 SQSTM1 互作，阻断自噬体与溶酶体融合，导致外泌体分泌增加，最终推动肺纤维化进程。该研究不仅阐明了 RIPF 发病中的关键细胞间通讯机制，还为靶向 TRIB3/SQSTM1 通路治疗放射性肺损伤提供了新的理论依据和潜在治疗方向。未来，针对 TRIB3 的小分子抑制剂或外泌体干预策略可能成为 RIPF 临床治疗的重要突破口。
研究结果为理解肺纤维化的复杂调控网络提供了新视角，同时强调了 AECⅡ 在纤维化进程中的主动调控作用，拓展了辐射损伤后组织修复与纤维化的研究领域。
