海洋细菌Pseudoalteromonas tunicata生物膜形成的关键钙依赖性黏附蛋白BapP的发现与功能解析

这篇研究通过比较蛋白质组学揭示了海洋细菌Pseudoalteromonas tunicata生物膜发育过程中248个关键蛋白，其中新发现的钙依赖性黏附蛋白BapP（EAR30327）通过AlphaFold结构预测和基因敲除实验证实其通过Type 1分泌系统（T1SS）介导生物膜稳定性，为海洋微生物生态学和抗生物膜策略提供了新靶点。

　　

ABSTRACT
海洋细菌Pseudoalteromonas tunicata是研究生物膜形成的经典模型，但其蛋白功能注释的缺失限制了机制解析。本研究通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）比较蛋白质组学，系统分析了从浮游状态到生物膜早期、中期和晚期的蛋白表达动态，鉴定出248个生物膜相关蛋白，包括已知的AlpP自溶酶、紫色素通路蛋白和S层蛋白SLR4，以及大量功能未知的假设蛋白。

Proteomic analysis of biofilm development in P. tunicata
实验通过静态培养72小时构建生物膜模型，结合主成分分析（PCA）和热图聚类发现：生物膜与浮游状态的蛋白谱显著分离，其中84个蛋白在静态浮游样本中富集，54个在振荡浮游样本中富集，而150个蛋白（如碱性磷酸酶EAR26932）在生物膜中特异性高表达。值得注意的是，假设蛋白EAR30327（后命名为BapP）在两类比较中均位列差异蛋白首位，其丰度在生物膜中较浮游状态提升6.8倍（log₂
FC）。

Structural modeling predicts BapP as a Ca²⁺
-dependent adhesin
AlphaFold3结构预测显示，BapP具有独特的N端β-螺旋桨结构域和12个免疫球蛋白样（Ig-like）重复单元，其中7个为钙调蛋白样（Calx-β）结构域。通过AlphaFill模拟发现多个保守的DxD基序构成钙离子结合位点，类似RTX（重复毒素）家族黏附素的刚性延伸机制。基因组共线性分析揭示其下游编码膜融合蛋白（MFS）和ABC转运体，暗示其可能通过T1SS分泌。

BapP is required for proper biofilm formation
基因敲除实验证实ΔbapP突变体的生物膜厚度减少44%（P=4.3×10^?7
），粗糙度增加2.5倍。晶体紫染色显示其生物膜形成能力下降5.7倍（P<0.0001），而回补株ΔbapP+可完全恢复表型。钙离子调控实验进一步揭示：在无钙培养基中，野生型生物膜形成被抑制（OD₅₅₀
从4.4降至1.5），而ΔbapP突变体仅微弱响应，证实BapP介导了Ca²⁺
依赖的生物膜稳定性。

Conclusion
该研究不仅提供了首个P. tunicata生物膜发育的蛋白质组图谱，更发现了一类新型钙依赖性黏附蛋白家族。BapP的结构-功能特征拓展了对细菌黏附素多样性的认知，其与T1SS的潜在关联为干预海洋生物膜提供了新思路。未来研究可聚焦BapP与胞外多糖（EPS）的相互作用及其在宿主定植中的作用。