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为解析 ABC 转运蛋白（ABC transporters）功能机制，研究人员针对细菌 ABC 输入蛋白开展定量蛋白质组研究，构建其细胞拷贝数和组分化学计量数据集，发现 SBP 与转运蛋白的化学计量差异，揭示其与底物丰度的关联，为理解其生理功能提供新视角。
在生命科学领域，ABC 转运蛋白（ATP 结合盒转运蛋白）作为最庞大且古老的蛋白质家族之一，在跨膜运输中扮演关键角色。其通过水解 ATP 获取能量，实现分子跨细胞膜转运。在人类中，ABC 转运蛋白不仅承担着保护细胞免受有毒物质侵害、将生物分子输送至指定区室的重任，还与多种人类疾病及肿瘤化疗耐药性密切相关。而在原核生物中，ABC 输入蛋白（ABC importers）作为高亲和力获取营养物质的媒介，在宿主感染等营养限制条件下，其作为关键毒力决定因素的作用尤为凸显。然而，目前关于原核生物 ABC 输入蛋白的细胞拷贝数、化学计量及其机制影响的认识仍不充分，且其在现有蛋白质组数据集中严重缺失，相关研究也未专门针对此类蛋白。
为填补这一研究空白，研究人员开展了一系列研究。由于现有数据中细菌 ABC 输入蛋白丰度差异显著，且不同研究间数据整合困难，研究人员以大肠杆菌 K12 菌株 BW25113 为研究对象，旨在构建统一且全面的 ABC 输入蛋白数据集。该研究成果发表在《SCIENCE ADVANCES》。
研究人员主要采用了以下关键技术方法：运用无标记串联质谱（LC-MS/MS）定量技术，对 ABC 输入蛋白进行分析；通过优化样本制备参数，包括蛋白酶、去污剂和膜洗涤试剂的选择，并结合不同协议数据集的合并，提高膜蛋白的检测覆盖率；利用相对强度绝对定量（riBAQ）等方法计算蛋白质的细胞拷贝数，并通过纯化蛋白标准物对结果进行验证。
编译 ABC 输入组数据集
通过搜索 EcoCyc 数据库，在大肠杆菌 K12 菌株 BW25113 基因组中鉴定出 47 个 ABC 输入系统，编码 47 个底物结合蛋白（SBP）、54 个核苷酸结合域（NBD）和 74 个跨膜结构域（TMD）。SBP 以单体形式发挥功能，而 NBD 和 TMD 则以二聚体形式存在，其中 NBD 和 TMD 分别有 7 个和 27 个系统为异源二聚体。现有 18 个大肠杆菌蛋白质组数据集对 ABC 输入组蛋白的覆盖不足，且不同数据集间丰度差异可达 500 倍。研究人员通过优化样本制备协议，发现膜分离制备结合碳酸氢钠洗涤或使用胰凝乳蛋白酶可提高检测覆盖率，但单一协议覆盖率仍不足 70%，故采用多协议数据集合并的方法。经与其他研究数据对比及纯化蛋白标准验证，所构建的数据集覆盖约 65% 的 ABC 输入组，为目前最全面的数据集。
ABC 输入组组件的丰度
ABC 输入组各组件丰度差异显著，SBP 丰度跨度超四个数量级，其中最丰富的 SBP 如 LivJ 和 MetQ，每细胞约 20,000 拷贝，而最少的如 BtuF 和 FhuD，平均每细胞仅 1-3 分子。SBP 丰度与底物结合亲和力无显著相关性，但与 SBP - 转运蛋白相互作用亲和力呈负相关，即高亲和力对应低丰度。此外，SBP 丰度与底物需求相关，结合肽和氨基酸的 SBP 丰度最高，其次为结合糖、离子的 SBP，结合维生素和铁载体的 SBP 丰度最低。NBD 和 TMD 的丰度层次与 SBP 相似，但 TMD 的细胞拷贝数远低于 NBD，这可能是由于 LC-MS/MS 对膜蛋白定量的技术限制所致。
SBP - 转运蛋白化学计量
在 I 型 ABC 输入系统（导入肽、氨基酸和糖）中，SBP 与转运蛋白的化学计量比大于 1，即 SBP 呈化学计量过量；而在 II 型系统（导入铁载体和维生素）中，该比例小于 1，转运蛋白呈过量状态。通过底物处理实验发现，尽管部分系统组件表达水平可受底物影响，但 SBP - 转运蛋白化学计量比基本保持稳定，表明该比例是系统固有属性。II 型系统中 SBP - 转运蛋白化学计量比小于 1 的现象与传统体外运输实验假设相悖，其机制可能与 II 型系统中 SBP 与转运蛋白的高亲和力相互作用有关。
表达与膜定位的相互依赖
膜分离分析显示，TMD 在膜组分中的丰度富集 5-6 倍，而 SBP 在膜组分中丰度较低，但 MetQ、BtuF 和 FhuD 这三种 SBP 在膜组分中富集。MetQ 通过脂质锚定与膜结合，而 BtuF 和 FhuD 作为 II 型系统 SBP，其膜定位完全依赖于同源 TMD，表明 II 型系统中 SBP 与 TMD 存在特异性相互作用。NBD 的表达不依赖同源 TMD，但其膜定位则完全依赖于 TMD。此外，异源二聚体 TMD 的缺失研究表明，部分 TMD 可独立插入膜中，且 NBD 的膜定位依赖于特定 TMD 亚基。
SBP - 转运蛋白化学计量的机制意义
I 型系统中 SBP 的化学计量过量是其功能的关键机制特征，如麦芽糖转运蛋白中 SBP（MalE）的减少会导致转运速率下降和碳源利用受损。而 II 型系统中转运蛋白的化学计量过量则是适应稀缺营养物质导入的策略。以 Btu 系统为例，在维生素 B12限制条件下，天然低水平 BtuF（BtuFlow）的细胞生长优势显著，而高表达 BtuF（BtuFhigh）会因游离 SBP 与结合底物的 SBP 竞争转运蛋白结合位点，导致摄取速率降低。这表明 I 型和 II 型系统分别通过不同的化学计量比优化了对高丰度和低丰度底物的获取效率。
热力学、构象动力学与化学计量的关联
II 型系统的 SBP 在结合底物时构象变化极小，导致转运蛋白难以区分游离和结合状态的 SBP，两者均以高亲和力结合转运蛋白。在底物稀缺时，SBP 化学计量不足可避免游离 SBP 堵塞转运蛋白。而 I 型系统的 SBP 在结合底物后发生显著构象变化，转运蛋白优先与结合底物的 SBP 相互作用，且复合物易解离，因此 SBP 化学计量过量可提高底物捕获效率。两种系统的不同机制体现了其与底物丰度和结合特性的协同进化。
表达调控机制
许多 ABC 输入系统在缺乏特异性底物时仍大量表达，呈组成型表达模式，以快速响应底物出现。而对于摄入过量可能有毒的底物（如锌、镍），其表达受底物响应转录元件严格调控。综合来看，ABC 输入系统的表达可能与细胞整体生理状态相关，需结合多组学技术进一步揭示其调控机制。
该研究通过整合蛋白质组分析与功能实验，揭示了 ABC 输入系统的细胞丰度、化学计量与其热力学 / 动力学特性、底物特异性的紧密关联。首次发现 II 型系统中 SBP 与转运蛋白的紧密膜定位及反向化学计量比，为理解 ABC 转运蛋白的功能机制提供了新范式，也为靶向 ABC 转运蛋白的疾病治疗及细菌毒力调控研究奠定了基础。研究结果表明，多组件系统的化学计量和亚细胞定位是优化其功能输出的关键因素，为解析复杂生物系统的协同进化提供了重要参考。
