单分子解析揭示变体PRC1复合物介导染色质泛素化的动态机制

本研究通过开发创新的单分子荧光成像技术，首次实时捕捉了变体PRC1复合物（含PCGF1/PCGF4亚型）在染色质上的动态结合与泛素化过程。研究发现PRC1通过瞬时采样染色质形成催化活性构象，招募E2~Ub完成H2AK118/K119泛素化，且PCGF亚型差异通过影响活性复合体形成概率决定酶活强弱。该成果发表于《Science Advances》，为表观遗传调控机制提供了动态视角，对理解胚胎发育和细胞命运决定中基因沉默的分子基础具有重要意义。

　　

在真核细胞中，染色质的动态调控如同交响乐指挥，通过组蛋白修饰（Posttranslational modifications, PTMs）精确控制基因表达。其中，多梳抑制复合物PRC1作为关键的"书写者"（writer），负责催化组蛋白H2A第118/119位赖氨酸（H2AK118/K119ub）的单泛素化，这一修饰对胚胎发育和细胞身份维持至关重要。然而，变体PRC1复合物（含PCGF1-6不同亚型）如何在动态染色质环境中识别靶位点并完成泛素化，不同亚型活性差异的分子机制始终是未解之谜。

为破解这一难题，国外研究团队开发了突破性的三色单分子全内反射荧光（smTIRF）技术体系。该研究通过重组表达荧光标记的人源PRC1.1（含PCGF1）和PRC1.4（含PCGF4）复合物，结合体外重构的12×601核小体阵列，建立了实时观测染色质结合-泛素化偶联反应的实验平台。关键技术包括：1）利用ybbR肽段标记实现PRC1亚基特异性荧光标记；2）化学泛素化制备H2AK118ub修饰染色质；3）酶法预载荧光泛素（JF₅₄₉-Ub）至E2（UbcH5c）以降低背景噪声；4）多通道同步成像解析PRC1结合（AF₆₄₇）、染色质定位（AF₄₈₈）和泛素转移（JF₅₄₉）的时空动态。

研究结果揭示：

1. 变体PRC1的动态染色质采样
   通过单分子追踪发现PRC1以双相动力学结合染色质：短暂结合事件（τ_res,1≈1.9秒）代表非特异性搜索，而长寿命结合（τ_res,2≈34秒）对应催化活性状态。E2存在使结合速率（k_on）提升至5×10⁵ M^-1s^-1，但预存的H2Aub修饰仅轻微延长停留时间，表明RYBP亚基的泛素识别域（NZF）对初始靶向贡献有限。

2. 弱持续性的泛素转移机制
   活性结合事件（τ_res,act≈20秒）中，E2~Ub招募（k_on≈3×10⁶ M^-1s^-1）后约10秒完成泛素转移。约50%事件发生单次修饰，33%实现相邻核小体的二次修饰，但三次以上事件罕见，表明PRC1以"试探-修饰-扩散"的分布式机制工作，而非长距离行进。

3. PCGF亚型决定活性的结构基础
   PRC1.1的催化效率是PRC1.4的3倍，但单分子分析揭示两者在活性状态下的反应动力学无差异。关键区别在于PRC1.4需经历更多非生产性结合（平均7次vs PRC1.1的2次）才能形成催化构象。构建PCGF4嵌合体（移植PCGF1的N端域或引入K73R突变）可显著提升活性，证实E2~Ub界面残基（如K73）和NTD螺旋是调控催化概率的关键元件。

这项研究首次在单分子水平描绘了染色质修饰酶"读取-书写"偶联的动态蓝图，阐明变体PRC1亚型特异性活性的结构基础。发现PCGF1通过优化E2~Ub界面促进活性复合体形成，为理解Polycomb系统在发育和疾病中的功能分工提供了机制解释。所建立的多色单分子技术平台为研究其他染色质调控因子开辟了新途径，对表观遗传药物开发具有重要指导价值。论文中关于"催化构象概率"的创新概念，可能普遍适用于解释修饰酶类的底物特异性与调控规律。