编辑推荐：
该研究利用土壤微生态系统，分析经质粒转化或基因组整合的工程化耻垢分枝杆菌（M. smegmatis）及其分枝杆菌噬菌体 Kampy 的存活与传播。发现两者在土壤中持续存在但扩散有限，原生生物群落或抑制噬菌体增殖，质粒存在负担但可长期保留，为工程微生物田间应用提供新见解。
研究背景与目的
健康土壤对维持生命至关重要，但其退化问题日益严峻。利用微生物改善土壤质量和作物健康具有广阔前景，然而外源及工程微生物在土壤中的存活和传播能力尚不确定。本研究旨在探究经质粒转化或基因组整合的工程化耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis）及其分枝杆菌噬菌体 Kampy 在灭菌和非灭菌土壤微生态系统中的存活与传播情况，为工程微生物在土壤环境中的应用提供理论依据。
材料与方法
- 菌株与噬菌体：构建了携带质粒 pCherry3 的Ms-pC3 菌株（质粒转化）和 mCherry 基因整合到基因组的Ms-pML (int) 菌株（基因组整合），选用分枝杆菌噬菌体 Kampy 作为研究对象。
- 土壤微生态系统构建：使用来自弗吉尼亚州威廉斯堡某家庭花园的土壤，部分经灭菌处理，部分保持非灭菌状态。构建 18 个微生态系统，包括灭菌和非灭菌土壤各 9 个，每个类型中分别设置对照组、Ms-pC3+Kampy 组和Ms-pML (int)+Kampy 组，每组 3 个重复。
- 接种与采样：在微生态系统中心接种细菌和噬菌体，分别在第 4、7、14、21、28、49 天从接种位点和距接种位点 5 cm 处采样，进行细菌菌落计数、噬菌体空斑计数、DNA 提取及测序分析等。
结果
工程化耻垢分枝杆菌的存活
- 绝对与相对丰度变化：在灭菌和非灭菌土壤中，工程化耻垢分枝杆菌的绝对丰度随时间均呈下降趋势，但在 49 天时仍可检测到，且显著高于对照组。灭菌土壤中，Ms-pC3 和Ms-pML (int) 的平均最终绝对丰度约为 107 CFU/g；非灭菌土壤中约为 106 CFU/g。非灭菌土壤中，通过 16S rRNA 分析显示其相对丰度下降 1.6 倍， shotgun 宏基因组分析也显示相对丰度呈下降趋势，但未达统计学显著水平。
- 土壤灭菌与工程方法的影响：土壤灭菌对耻垢分枝杆菌的丰度无显著统计学影响，但在非灭菌土壤中，基因组整合菌株Ms-pML (int) 的丰度显著高于质粒转化菌株Ms-pC3，表明质粒可能对宿主细菌存在一定负担。
噬菌体 Kampy 的存活与扩散
- 丰度差异：噬菌体 Kampy 在灭菌和非灭菌土壤中均能持续存在，但灭菌土壤中的丰度显著高于非灭菌土壤。在灭菌土壤中，Kampy 丰度在 28 天前呈上升趋势，之后稳定在约 109 PFU/g；非灭菌土壤中丰度则稳定在约 104 PFU/g，表明非灭菌土壤中的原生生物和病毒群落可能抑制了噬菌体的增殖。
- 扩散能力：在灭菌土壤中，与Ms-pC3 共接种的 Kampy 在 5 cm 处的丰度随时间显著变化，显示出一定的扩散能力；而在非灭菌土壤中，无论是哪种工程菌株，Kampy 在 5 cm 处的丰度与对照组均无显著差异，表明非灭菌土壤环境可能限制了噬菌体的扩散。
质粒保留情况
- 质粒丢失趋势：通过对Ms-pC3 菌株的粉色菌落百分比分析发现，随着时间推移，质粒丢失现象明显。在灭菌和非灭菌土壤中，粉色菌落百分比分别下降 63% 和 45%，表明质粒在无选择压力下会逐渐丢失，但仍有部分细菌保留质粒。
对土壤微生物群落结构的影响
- 主成分分析（PCA）：基于 16S rRNA 和 shotgun 宏基因组数据的 PCA 分析显示，接种工程化耻垢分枝杆菌和噬菌体 Kampy 会影响非灭菌土壤的微生物群落结构，样品按时间聚类，且接种初期（第 4 天）的群落结构与对照组差异明显，表明外源微生物的引入会对土壤微生物群落产生短期干扰，随后逐渐趋于稳定。
讨论
- 工程微生物的存活与挑战：工程化耻垢分枝杆菌和噬菌体 Kampy 在土壤中能够持续存在 49 天，显示出一定的环境适应能力，但在非灭菌土壤中面临更多挑战，如营养竞争、原生生物捕食等，导致其丰度下降更为明显。基因组整合菌株的优势表明，减少质粒负担可能是提高工程微生物在复杂环境中存活能力的有效策略。
- 噬菌体的生态作用：灭菌土壤中噬菌体 Kampy 的高丰度和扩散能力提示，在缺乏原生病毒群落竞争的环境中，噬菌体能够有效增殖和扩散；而非灭菌土壤中噬菌体的低丰度可能与原生噬菌体的竞争、细菌的抗性机制或营养限制导致的细菌休眠有关。
- 质粒的应用局限性：质粒转化菌株的质粒丢失现象表明，在长期应用中，质粒的稳定性可能是一个关键问题。基因组整合技术可避免质粒丢失，但需要更复杂的遗传操作，两者各有优缺点，需根据具体应用场景选择合适的工程方法。
结论
本研究首次同时分析了工程化细菌及其相关噬菌体在灭菌和非灭菌土壤微生态系统中的存活与传播，发现两者在土壤中能够持续存在，但扩散能力有限。非灭菌土壤中的原生生物群落对噬菌体的增殖和扩散具有抑制作用，质粒的存在会对宿主细菌产生一定负担，导致质粒逐渐丢失。这些结果为工程微生物在土壤修复、可持续农业等领域的应用提供了重要的理论依据，未来需进一步开发提高微生物在非灭菌土壤中持久性和扩散能力的策略。
