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该研究针对下呼吸道感染（LRTI）病原检测难题，验证靶向二代测序（tNGS）性能。通过模拟样本和临床标本证实其分析特异性、敏感性等良好，且在检测时间、成本上优于传统方法，为临床应用提供理论依据。
下呼吸道感染（LRTI）是全球严重公共卫生问题，其病原微生物检测困难。靶向二代测序（tNGS）作为微生物检测领域的新兴技术，具有巨大潜力。本研究旨在验证 tNGS 的检测性能，为其在临床诊断中的推广应用提供理论依据。
材料与方法
- 患者和样本：收集首都医科大学附属北京积水潭医院住院或门诊患者的痰或支气管肺泡灌洗液（BALF）样本，这些患者均完成培养或恒温扩增基因芯片检测以确认是否存在引起 LRTI 的病原体。
- tNGS 分析性能特征评估：制备 22 个模拟微生物样本组，用于评估 tNGS 的分析特异性、敏感性、干扰、稳定性和精密度等性能。
- tNGS 检测流程：包括核酸提取和定量、cDNA 合成、靶向扩增、扩增产物纯化，最后进行文库制备和纯化。使用特定的试剂盒和测序仪，在检测过程中设置阴性质量控制以消除假阳性和污染。
- 生物信息学分析：使用数据管理和分析系统，对原始数据进行低质量过滤，通过自建临床病原体比较数据库等确定样本中特定扩增靶点的读取计数，识别潜在的耐药基因和毒力基因。
- 结果解释：将 tNGS 检测到的病原体分为明确、可能、可能和不太可能四类。
- 统计分析：分类变量以百分比表示，连续变量以均值和标准差表示，计算敏感性、特异性等指标，使用相应软件进行数据分析。
结果
- 分析有效性：tNGS 成功检测了用于评估分析特异性的样本组，能准确区分浓度差异 10 倍的密切相关微生物。不同病原体的检测限（LoD）不同，微生物浓度与 RPM 值呈强线性相关，定性精密度达 100%，药物干扰对检测无影响，在 - 80°C 和 4°C 存储样本检测稳定，室温存储影响较大。
- 临床有效性：在 108 份临床样本中，tNGS 检测结果与培养、培养联合恒温扩增基因芯片法和综合诊断标准的符合率分别为 69.44%、84.26% 和 97.22%。tNGS 检测到的病原体谱更广，包括细菌、真菌、病毒和非典型病原体，还检测到多种毒力和耐药基因。
讨论
tNGS 在分析有效性方面，能准确检测含多种病原体的样本，在同时检测不同类型病原体和区分密切相关微生物方面具有显著优势。与其他方法相比，tNGS 在检测非典型病原体、混合感染和培养阴性但疑似感染的患者方面具有优势，样本周转时间（TAT）显著短于传统培养方法，测序深度在保证准确性的同时降低了成本。但 tNGS 目前缺乏结果解释标准，对痰样本的结果解读具有挑战性，且在耐药基因研究等方面存在局限性。未来需要建立质量控制标准和标准化操作程序，优化引物设计，加强分子诊断专家与临床医生的合作。
结论
本研究利用参考材料制备模拟微生物样本组，制定了全面的验证方案来评估 tNGS 在诊断 LRTIs 中的分析有效性，为临床应用提供了现成的范例。通过实际临床样本检验 tNGS 的临床有效性，发现其能可靠地检测 LRTIs 中的常见病原体，包括识别混合感染和非典型病原体。从临床实用性角度看，tNGS 显著缩短了 TAT。经过全面验证，tNGS 工作流程表现良好，有望在临床实践中用于辅助 LRTIs 的诊断和患者管理。
