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本研究探讨铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）蛋白酶 IV（PIV）在大蜡螟（Galleria mellonella）幼虫感染模型中的作用。发现 piv 基因表达具温度依赖性，25℃时更高，但敲除 piv 未显著影响菌株毒力，提示单一毒力因子缺失可能因菌其他毒力因子存在而难以在高敏感模型中显现差异。
研究背景与目的
铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是重要的机会致病菌，可感染哺乳动物、无脊椎动物和植物。蛋白酶 IV（Protease IV，PIV，又称 PrpL）是其分泌的丝氨酸蛋白酶，在哺乳动物角膜、肺和伤口感染模型中被证实与毒力相关，且在多种无脊椎动物模型中也发挥作用。此前研究发现，编码 PIV 的piv基因在 25℃时的表达水平高于 37℃，因此推测piv在低温下对铜绿假单胞菌毒力的影响更显著。本研究利用大蜡螟（Galleria mellonella）幼虫这一非哺乳动物模型，探究piv基因在不同温度下对铜绿假单胞菌毒力的作用。
材料与方法
- 菌株构建与培养：使用 CRISPR-Cas9 系统构建piv基因缺失突变株 Δpiv，并通过 PCR 和测序验证。铜绿假单胞菌 PAO1 及其突变株在 LB 培养基中分别于 25℃和 37℃培养，测定生长曲线以确认突变株无生长缺陷。
- 蛋白分泌检测：利用 VSV-G 标签标记 PIV，通过免疫印迹（Western Blot）检测不同温度下培养的 PAO1 菌株上清液中成熟 PIV 的含量，证实 25℃时分泌量更高。
- 大蜡螟感染实验：将 PAO1 和 Δpiv以不同接种量（100 CFU 和 10 CFU）感染大蜡螟幼虫，分别在 25℃和 37℃下培养，通过 Kaplan-Meier 生存曲线分析死亡率差异。同时提取感染后幼虫血淋巴，利用 RT-qPCR 检测piv基因的表达情况。
结果与讨论
- 温度对 PIV 分泌的影响：免疫印迹结果显示，PAO1 在 25℃培养时分泌的成熟 PIV 蛋白量显著高于 37℃，与piv基因的温度调控表达一致。
- piv 缺失对毒力的影响：无论是在 25℃还是 37℃，PAO1 和 Δpiv感染的大蜡螟幼虫存活率均无显著差异。尽管两菌株在 37℃时的毒力更强（幼虫中位存活时间更短），但敲除piv未导致毒力减弱。低接种量（10 CFU）实验中，早期死亡率虽有轻微差异，但最终死亡率相近，表明piv缺失不影响整体毒力。
- 基因表达与毒力机制分析：RT-qPCR 证实piv在感染过程中持续表达，排除了因基因不表达导致毒力无差异的可能。推测铜绿假单胞菌拥有多种毒力因子（如 III 型分泌系统 TTSS），单一piv缺失不足以在高度敏感的大蜡螟模型中显现毒力变化。此外，大蜡螟与其他无脊椎动物模型的宿主差异（如先天免疫因子差异）可能导致 PIV 的作用不同。
结论与意义
本研究表明，在大蜡螟幼虫模型中，piv基因并非铜绿假单胞菌毒力的关键决定因素，温度对菌株毒力的影响显著（37℃时更强），但与piv无关。研究结果提示，大蜡螟模型可能无法检测单一毒力因子缺失引起的细微毒力变化，强调了选择合适模型进行毒力研究的重要性。此外，不同宿主模型中铜绿假单胞菌毒力机制的差异值得进一步探讨，为理解病原菌与宿主互作提供了新视角。
