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为解决畜牧业益生菌制剂开发问题,研究人员从工业猪盲肠食糜中分离淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylovorus)KSAU 菌株,开展全基因组测序及抑菌相关基因研究。发现其含 11 个细菌素(如乳球菌素、瑞士菌素)合成基因,为猪用益生菌研发提供依据。
当前畜牧业趋势是使用基于乳酸微生物的益生菌制剂,这类制剂可抑制病原菌并维持农场动物胃肠道有益微生物。从工业猪(由 “Piatachok” 公司提供)食糜中分离出乳酸杆菌菌株,这些菌株对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和大肠杆菌(Escherichia coli)表现出拮抗特性。分离株在 “双歧杆菌” 培养基(奥博伦斯克 FBSIS 应用微生物学和生物技术国家研究中心)中于 37℃培养 48 小时,选择拮抗活性最强的分离株进行全基因组测序(WGS)。
将液体细菌培养物在 MRS 培养基中于 38℃孵育 48 小时,取 0.5 mL 细菌培养物以 13,000 rpm 离心 5 分钟。使用德国 QIAGEN 公司的 DNeasy 血液和组织试剂盒提取 DNA,利用美国 Illumina 公司的 DNA 制备(M)标签化试剂盒制备全基因组测序文库,并通过美国 Thermo Fisher 公司的 Qubit 荧光计评估质量和数量。测序在 MiSeq 设备上进行,使用 2×150 bp MiSeq 试剂微型试剂盒 v2(美国 Illumina 公司)。
使用 FastQC v.0.11.9 进行读长质量控制,通过 Trimmomatic v.0.39 去除接头。利用 UGENE 程序(内置 SPAdes v.3.15.3)进行基因组从头组装,借助 QUAST v.5.0.2 评估基因组组装质量。使用 NCBI 原核基因组注释管道(PGAP)6.7 版注释编码序列(CDs),除非另有说明,否则使用默认参数。
共获得 8,923,418 条读长,淀粉乳杆菌 KSAU 基因组组装得到 336 个重叠群,最终长度为 2,194,806 bp,N50 值为 33.1 kb,GC 含量 38%,基因组覆盖率 133.9×,有 2,216 个蛋白质编码序列。此外,PGAP 注释出 5 个 rRNA、63 个 tRNA、3 个非编码 RNA、131 个假基因和 11 个细菌素合成 CDs,包括乳球菌素和瑞士菌素。通过类型(菌株)基因组服务器,利用数字 DNA-DNA 杂交确定分离株的分类归属,其与淀粉乳杆菌菌株 DSM 20531(GCA_002706375.1)的一致性最高(69.5%)。
本研究由斯洛伐克研究与发展署资助(编号 APVV-20-0246)。