编辑推荐：
本综述聚焦蛋白酶工程，介绍在大肠杆菌（E. coli）、酵母、噬菌体及无细胞系统中改造蛋白酶底物特异性的定向进化和高通量策略，探讨抗体 - 蛋白酶融合等新兴策略，以及分裂和自抑制蛋白酶的设计原理，展现该领域最新进展。
蛋白酶催化肽键水解，在生物体中广泛存在且功能多样，是众多治疗策略的关键靶点。蛋白酶工程早期聚焦酶稳定性和重组表达优化，如用于洗涤剂的细菌蛋白酶及治疗血液等疾病的蛋白酶替代疗法。但长期以来，改造底物特异性等核心属性进展有限。近十五年，蛋白工程、定向进化、结构生物学、生物信息学及计算和机器学习方法的进步，推动了蛋白酶设计与应用进入新阶段。
传统观点认为蛋白酶识别靶蛋白中短氨基酸基序（PX–P1/P1’–PX’，P1/P1’为切割键），对应酶亚位点为 SX-S1/S1’-SX’。早期通过理性改造亚位点尝试改变底物特异性，如将胰蛋白酶转为胰凝乳蛋白酶、MMP16 转为 MMP17，效果有限，这表明仅改造活性位点突变不足够，亚位点残基串扰、活性位点外（如外位点）突变均影响底物结合和催化效率，工程化条件激活蛋白酶也面临类似复杂问题。
成功改造蛋白酶特异性和活性依赖有效探索其适应度景观并筛选所需变体的方法。本综述介绍相关工具和原理，及其在生物技术和 biomedicine 中的应用。首先探讨在大肠杆菌、酵母和无细胞蛋白表达系统中实施的高通量筛选和选择策略。例如，若目标是提高蛋白酶催化效率（提升催化周转数kcat），需设计通过创造时间压力或在高底物 - 酶化学计量比下运行来筛选更快变体的方案。
其次讨论基于计算的策略来设计分裂蛋白酶。分裂蛋白酶作为蛋白回路中的关键信号处理模块，其工程化设计有特定原理。
还重点介绍利用蛋白质 - 蛋白质相互作用来改变蛋白酶活性和特异性的新兴方法。如蛋白酶 - 抗体融合，借鉴诱导分子邻近概念，将蛋白酶与靶向底物的蛋白结合剂融合，可增强蛋白酶对生理底物的靶向和活性，为改造蛋白酶底物特异性提供了新途径。
尽管通过定向和连续进化工具（表 1），具有新特异性和活性的蛋白酶工程在探索新功能领域取得进展，但仍面临挑战。例如，许多研究聚焦基于大肠杆菌的进化系统，而其缺乏翻译后修饰（PTM）能力，在进化需要 PTM 的蛋白酶时存在困难。
总之，蛋白酶工程随着工业和医学应用中理解和利用蛋白水解活性的需求增加而不断发展，本综述为该领域在生物技术和治疗进展中的理解提供了有价值的见解。
