综述：工程化催化混杂酶以实现新功能

（编辑推荐）本综述系统探讨了酶催化混杂性（Catalytic Promiscuity）的分子机制与工程化策略，揭示了其通过底物结合模式差异、高能中间体不稳定性及关键残基作用等实现多功能催化的特性。重点介绍了定向进化（Directed Evolution）、理性设计及人工智能辅助设计（AI-aided Design）在优化酶活性与立体选择性（Stereoselectivity）中的应用，为开发新型生物催化剂（Biocatalysts）如细胞色素P450（CYP）提供了理论支撑。

　　

Abstract

酶催化混杂性指酶在天然活性外催化多种化学反应的特性，这一现象在自然界广泛存在并推动酶功能进化。通过蛋白质工程（Protein Engineering）改造天然酶或从头设计（de novo Design）人工酶，可突破天然催化界限，实现非天然反应（如光诱导氧化还原酶催化）。关键影响因素包括底物预反应态结合模式差异、高能中间体不稳定性及催化残基作用，环境扰动（如有机溶剂）亦可诱导新反应类型。

Introduction

酶的传统高特异性认知已被催化混杂性（Catalytic Promiscuity）、底物混杂性（Substrate Promiscuity）和条件混杂性（Conditional Promiscuity）三类现象颠覆。例如甲烷单加氧酶可羟基化150种底物，脂肪酶在无水介质中仍保持活性。Y?as-Jensen理论认为，祖先酶的多功能性为现代酶专业化奠定基础，而残留混杂活性为工业生物催化（如CYP工程化）提供进化起点。

Recognizing Divergence in Enzyme Catalytic Mechanisms

完整催化循环包含底物结合、预反应构象稳定、过渡态形成及产物释放四阶段。底物结合口袋的柔性（如疏水腔扩张）允许非天然底物进入，而关键残基（如His/Asp）质子转移网络不稳定可能触发混杂反应。光敏辅因子（如FAD）的激发态可驱动非天然氧化还原路径。

Main Strategies for Engineering Promiscuous Enzymes

1. 定向进化：通过易错PCR（epPCR）和基因 shuffling 强化P450环丙烷化活性；
2. 理性设计：基于QM/MM计算精准突变活性中心（如转氨酶立体选择性的赖氨酸变体）；
3. 人工智能辅助：AlphaFold2预测蛋白质折叠，机器学习挖掘未注释酶功能；
4. 环境调控：固定化酶在离子液体中提升酯合成效率10倍。

Conclusion and Perspective

催化混杂性研究为“自然未设计”反应（如C-H键活化）提供了酶工程蓝图。未来需结合AI预测与自动化实验平台，破解催化机制黑箱，开发兼具工业稳定性（如耐高温PET水解酶）与创新活性（如碳硅键形成酶）的下一代生物催化剂。

（注：全文严格依据原文缩编，未新增观点或数据）