综述：酶法从头寡核苷酸合成的新兴技术与进展

这篇综述系统探讨了酶法寡核苷酸合成（TdT/PUP介导）的技术演进，对比传统磷酰胺化学法的局限性（如200 nt长度瓶颈、有机溶剂污染），重点解析了末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）的工程化改造、可逆终止剂（3′-O-azidomethyl/ONH2）设计及固相合成平台创新，为DNA数据存储和核酸药物开发提供了绿色解决方案。

　　

酶法寡核苷酸合成技术正掀起分子生物制造的革新浪潮。传统磷酰胺化学法虽仍是工业金标准，但其合成长度受限（约200 nt）、累积错误率高及有毒溶剂依赖等痛点，促使学界将目光转向具有天然精准性的酶催化体系。

模板非依赖合成：TdT的王者之路
末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）因其独特的模板非依赖性成为明星酶。从牛胸腺中首次分离的TdT，经结构解析发现其活性中心由指状、掌状、拇指状和8-kDa结构域构成隧道状空腔，关键长环结构（Loop 1）赋予其随机聚合特性。通过定向进化改造，工程化TdT（如ZaTdT）对3′-O修饰底物的催化效率提升显著。金属离子调控堪称点睛之笔——Co²⁺增强嘧啶底物偏好性，而Mg²⁺则促进嘌呤聚合，这种"离子开关"特性为精准合成提供调控维度。

可逆终止剂的化学博弈
3′-OH封闭策略中，三大终止剂各领风骚：3′-O-叠氮甲基（3′-O-azidomethyl）通过Staudinger反应被TCEP温和切除；3′-O-烯丙基（3′-O-allyl）凭借钯催化Tsuji-Trost反应实现30秒快速脱保护；而3′-ONH₂则利用亚硝酸钠缓冲液在1分钟内完成高效切割。有趣的是，光敏性2-硝基苄基和热敏感四氢呋喃衍生物等新型终止剂，正为无试剂化合成开辟新路径。

固相合成平台的智能升级
从磁珠到LCAA-CPG（长链烷胺可控孔玻璃），固相载体的革新显著降低错误率。DNA Script开发的微流控芯片结合喷墨打印技术，实现96通道并行合成。而锚定策略更是脑洞大开：铜游离点击化学（SPAAC）将DBCO修饰引物与叠氮玻片共价结合，空间位阻优化使酶分子"舞蹈空间"达到完美平衡。

超越DNA的合成边疆
酶法合成技术正在突破天然核酸界限：CID1 poly(U)聚合酶突变体实现2′-F/2′-OMe修饰RNA的固相合成；锁核酸（LNA）和己糖醇核酸（HNA）等XNA的酶法构建，为核酸药物开发提供新武器。更令人振奋的是，KOD聚合酶介导的模板依赖合成，已能规模化生产全Rp构型磷硫酰反义核酸（如福米韦生），纯度达87%。

商业转化赛道已呈百花齐放态势：DNA Script的SYNTAX打印机实现120 nt合成，Ansa生物采用TdT-dNTP偶联物创下1005 nt记录，而Camena Bioscience的三核苷酸砌块策略更突破至2.7 kb质粒合成。尽管当前酶法合成成本仍较高，但随着AI辅助酶设计和高通量分析技术的发展，这场绿色合成革命必将重塑生命科学产业链。

未来挑战清晰可见：99.9%的步进效率阈值需要突破，二级结构干扰尚待解决，而酶制剂低温保存需求对设备提出新要求。但可以预见，随着冷冻电镜解析TdT-底物复合物结构等基础研究的深入，酶法合成终将成为寡核苷酸制造的黄金标准。