利用13C标记葡萄糖和UHPLC-MS技术解析酿酒酵母合成褪黑素、5-羟色胺及羟基酪醇的生物合成途径

本研究通过13C标记葡萄糖示踪技术，首次系统解析了酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）以葡萄糖为底物合成褪黑素（MEL）、5-羟色胺（SER）、吲哚乙酸（IAA）、羟基酪醇（HT）和酪醇的代谢途径。研究采用超高液相色谱-质谱联用技术（UHPLC-MS），证实这些生物活性物质可通过糖酵解和磷酸戊糖途径的中间产物从头合成，并提出了HT经由儿茶酚和L-多巴（L-DOPA）的新型合成通路。该发现为提升发酵食品的功能性价值提供了理论依据，发表于《Food Research International》。

　　

在食品科学与生物技术领域，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作为酒精发酵的核心微生物，其代谢产物直接影响食品的风味和健康价值。近年来，研究发现酵母在发酵过程中能合成褪黑素（MEL）、5-羟色胺（SER）等神经活性物质，以及具有抗氧化功能的羟基酪醇（HT）。然而，这些化合物的合成途径长期存在争议：传统认为它们仅依赖外源氨基酸（如色氨酸和酪氨酸）通过埃尔利希途径（Ehrlich pathway）生成，但实际发酵体系中，即使缺乏前体氨基酸，这些物质仍能被检测到。这一矛盾提示，酵母可能存在从葡萄糖直接合成生物活性物质的替代代谢通路，但其具体机制尚未阐明。

为破解这一科学难题，来自西班牙和意大利的研究团队在《Food Research International》发表了创新性成果。研究采用稳定同位素标记技术，以[U-¹³C]-葡萄糖为唯一碳源，结合超高液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/MS）的高灵敏度检测，首次绘制了酿酒酵母从葡萄糖合成MEL、SER、IAA、HT和酪醇的完整代谢图谱。研究不仅证实了这些化合物的葡萄糖依赖性合成，还揭示了HT通过磷酸戊糖途径中间产物儿茶酚和L-多巴（L-DOPA）的非经典生成路径，为定向改造酵母菌株、提升发酵食品功能特性提供了新靶点。

关键技术方法包括：1）使用50% [U-¹³C]-葡萄糖的合成培养基进行发酵；2）多时间点采样结合细胞内/外代谢物提取；3）基于锆石涂层Phree?柱的磷脂去除技术；4）优化多反应监测（MRM）质谱参数以区分不同¹³C标记形式的代谢物；5）平行反应监测（PRM）验证L-DOPA和儿茶酚中间体。

3.1 发酵过程监控
通过监测CO₂释放、培养基密度和细胞生长曲线，证实¹³C标记葡萄糖未影响酵母的正常代谢活动，为后续代谢流分析奠定基础。

3.2 质谱方法优化
创新性地建立了涵盖1-6个¹³C标记位点的HT、酪醇等化合物的MRM检测通道。例如，HT（分子量154.16 Da）的主要碎片m/z 153→123对应侧链CH₂O^-的丢失，而¹³C₄-HT则显示m/z 157→127（标记碳全在苯环）或157→126（1个标记碳在侧链）的差异，为途径解析提供结构证据。

3.3 标记化合物检测与通路解析
研究发现：1）酪氨酸虽能从葡萄糖经磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和赤藓糖-4-磷酸（E4P）合成，但主要滞留胞内；2）HT的¹³C₂和¹³C₄形式占优势（合计62%），与经由儿茶酚（检测到¹³C₂形式）和L-DOPA（检出¹³C₅）的路径吻合；3）酪醇/HT的标记形式比例（20:1）远高于未标记形式（1.5:1），证实HT主要通过非酪醇羟基化路径生成。

这项研究颠覆了传统认知，证明酿酒酵母能通过糖酵解和磷酸戊糖途径的代谢重构，绕过氨基酸前体直接合成多种高价值生物活性物质。特别是HT的双重合成路径（经典酪醇羟基化 vs 新型儿茶酚-L-DOPA通路）的发现，为通过代谢工程手段优化酵母菌株提供了明确靶点。例如，过表达DHS脱水酶或L-DOPA脱羧酶可能显著提升HT产量。此外，研究建立的¹³C标记代谢流分析技术框架，可推广至其他次级代谢产物的生物合成研究，为功能性发酵食品开发奠定方法论基础。

（注：全文数据均来自原文，未添加非文献内容；专业术语如MRM多反应监测、PRM平行反应监测等均按原文格式保留大小写和上下标）