环状RNAGFP通过非RNAi途径在拟南芥原生质体中实现序列特异性GFP蛋白丰度调控

本研究针对农业生物胁迫防控中RNA稳定性差和免疫原性高的技术瓶颈，创新性设计靶向GFP的环状RNA（circRNAGFP），在拟南芥原生质体模型中证实其能通过非RNA干扰（RNAi）途径实现序列特异性蛋白抑制，且不触发模式触发免疫（PTI），为开发新型circRNA农业调控工具奠定理论基础。

　　

气候变化加剧背景下，农作物面临日益严重的生物和非生物胁迫威胁。传统农药使用受限，而基于RNA干扰（RNAi）的双链RNA（dsRNA）技术虽具潜力，却面临环境易降解、可能触发植物免疫反应（如模式触发免疫PTI）以及潜在抗性风险等应用瓶颈。环状RNA（circRNA）因其独特的共价闭合环状结构，在动物系统中已证实具有卓越的稳定性和低免疫原性，但在植物基因调控中的应用价值尚属空白。

德国吉森大学联合法国斯特拉斯堡大学的研究团队在《Plant Cell Reports》发表突破性研究，首次证实人工设计的环状RNA能在植物中实现序列特异性蛋白调控。研究人员通过PEG介导的拟南芥叶肉原生质体转染系统，结合荧光定量、免疫印迹和PTI标志物检测等技术，系统评估了50-nt circRNAGFP对GFP报告蛋白的调控效应及其作用机制。

研究结果显示，circRNAGFP能剂量依赖性地降低GFP蛋白水平（降幅达显著水平），而线性对照linRNAGFP仅产生短暂抑制效应。关键发现包括：（1）结构特异性：闭合环状构象对持续抑制效果至关重要；（2）序列特异性：含30-nt GFP反义序列的circRNAGFP显著优于随机序列对照circRNACTR₁；（3）通路独立性：在dcl1-11、dcl2,3,4等多重RNAi缺陷突变体中仍保持活性；（4）翻译层调控：qPCR证实GFP转录本水平未受影响；（5）低免疫原性：circRNA处理不诱导胼胝质沉积、MAPK磷酸化或活性氧（ROS）爆发等PTI标志事件。

技术方法上，研究采用体外转录合成circRNA，通过T4 RNA连接酶环化并经RNase R消化验证完整性。利用35S启动子驱动的pGY1-35S::GFP/RFP双报告系统转染拟南芥野生型及dcl、ago系列突变体原生质体，通过荧光显微镜成像和ImageJ定量分析蛋白表达，Western blot验证蛋白水平变化，同时建立胼胝质染色、MAPK磷酸化检测和ROS爆发实验评估免疫反应。

在讨论部分，作者强调circRNA相较于传统dsRNA的三大优势：核酸酶抗性赋予的环境稳定性、非RNAi机制避免靶标抗性风险、以及低免疫原性带来的应用安全性。该研究不仅首次揭示circRNA在植物系统中的翻译调控功能，更为开发新型circRNA农用制剂（如抗病诱导剂、除草剂）提供了概念验证。未来研究需突破植物叶面递送技术障碍，并探索circRNA在整株水平上的代谢调控潜力。

这项开创性工作为植物基因调控工具箱增添了新成员，其揭示的circRNA独特作用机制为应对农业可持续发展挑战提供了全新思路。特别是circRNA规避植物免疫监视的特性，使其在需要长期稳定作用的场景（如抗病育种、杂草防控）中展现出独特应用前景。