基于结构域交换的同源酶改造策略提升尸胺产量的研究

本研究针对大肠杆菌中赖氨酸脱羧酶CadA在碱性条件下稳定性差、催化效率低的问题，通过结构分析指导的同源酶LdcC区域交换策略，成功构建了具有更高pH稳定性和PLP亲和力的嵌合酶CL2。实验证实，表达CL2的工程菌株BLCL2在摇瓶培养中尸胺产量达到1.12 g/L，较野生型提高1.96倍。该研究为生物基聚酰胺单体生产提供了高效生物催化剂，同时展示了结构引导的蛋白质工程新方法。

　　

在生物基材料快速发展的今天，尸胺（cadaverine）作为一种重要的C₅二胺分子，在医药、农业和聚酰胺生产领域展现出巨大潜力。这种化合物可通过微生物发酵从可再生碳源或赖氨酸生物转化获得，其中大肠杆菌是最常用的生产宿主。然而，当前生物法生产面临一个关键瓶颈：大肠杆菌中高活性的赖氨酸脱羧酶CadA在碱性条件下会迅速失活，这恰恰是尸胺合成过程中不可避免的环境变化——因为每转化1分子赖氨酸就会消耗1个质子，导致胞内pH升高。

自然界中，大肠杆菌其实拥有两套赖氨酸脱羧系统：除了酸诱导型的高活性CadA外，还有组成型表达但活性较低的LdcC。有趣的是，LdcC具有广谱pH稳定性，这为研究者提供了灵感——能否通过"取长补短"的方式，将LdcC的结构稳定特性移植到CadA上？来自浦项科技大学、韩国化学技术研究院等机构的研究团队在《Microbial Cell Factories》发表的研究给出了肯定答案。

研究人员采用的主要技术方法包括：基于序列和结构相似性分析设计嵌合酶构建策略；通过Gibson组装构建六种区域交换突变体；利用细胞裂解液和纯化酶进行pH稳定性和PLP亲和力测定；结合FoldX和AutoDock Vina进行相互作用能和配体对接模拟；采用HPLC和UFLC系统进行代谢物定量分析。

研究结果部分，"Construction of chimeric variants based on structural analysis of LdcC and CadA"显示，CadA与LdcC具有70%序列相似性和高度结构相似性（RMSD=1.58），这为成功的区域交换奠定了基础。研究人员将CadA划分为六个约120个氨基酸的连续片段，分别用LdcC对应区域替换，构建了CL1-CL6系列突变体。

"Validation of the chimeric variants through cadaverine production tests"部分发现，表达CL2（第2区域被替换）的BLCL2菌株表现最佳，摇瓶培养中尸胺产量达1.12 g/L，是野生型CadA菌株的1.96倍。值得注意的是，该菌株还表现出生长迟缓和乙酸产量降低，这与其增强的赖氨酸转化效率相关。

"Structural analysis and in vitro assay of the effective mutant"揭示了CL2的优越性能机制：区域2在二聚体形成中起关键作用，其替换显著增强了pH稳定性。在pH 9.0时，CL2保留了70.6%的最大活性，而野生型仅剩27.5%。分子对接显示CL2的PLP结合能（-6.1 kcal/mol）优于CadA（-5.5 kcal/mol），这解释了其在低PLP浓度下仍保持64.6%活性的优势（野生型为47.9%）。

讨论部分强调，这项研究实现了三个重要突破：首先，通过非传统的"区域交换"而非经典"结构域交换"策略，成功整合了同源酶的优势特性；其次，阐明了二聚化界面和PLP结合亚域在维持酶活中的关键作用；最后，工程菌株的产量提升为工业化生产奠定了基础。特别值得注意的是，CL2对PLP的高亲和力可能降低工业化生产中的辅因子添加成本，这是经济性生产的重要考量。

该研究不仅提供了尸胺生物合成的优化方案，更展示了一种结构引导的蛋白质工程新范式。未来，结合代谢工程策略（如删除speE等尸胺降解基因）和发酵工艺优化，有望进一步放大这一技术的工业价值。这种"自然进化启发"的酶设计思路，也为其他工业生物催化剂的开发提供了宝贵参考。