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为解决细菌 I.1/I.2 亚家族脂肪酶（Lif）依赖性预测难题，研究人员分析基因组中 Lif 基因存在情况并结合系统发育分析，鉴定出无 Lif 的 P. fragi/P. vulgaris 和 P. shioyasakiensis 分支，开发了预测方法，为工业应用提供新资源。
在微生物酶工程领域，细菌脂肪酶（Lipase）作为催化酯键水解的关键酶，广泛应用于洗涤剂、生物柴油等工业生产。然而，细菌 I.1 和 I.2 亚家族脂肪酶中多数需要依赖脂肪酶特异性折叠酶（Lipase-specific foldase，Lif）才能正确折叠为活性形式，这一特性导致其在异源表达系统（如大肠杆菌）中难以高效生产，限制了工业应用潜力。尽管少数 I.1 亚家族脂肪酶（如来自 Pseudomonas fragi 和 Proteus vulgaris 的脂肪酶）被发现不依赖 Lif 即可激活，但缺乏通用的 Lif 依赖性预测方法，且对非依赖型脂肪酶的分子机制和进化特征认识不足。因此，开发一种可靠的预测模型并挖掘更多 Lif 非依赖型脂肪酶资源，成为突破细菌脂肪酶工业应用瓶颈的关键科学问题。
日本花王公司（Kao Corporation）的研究人员 Takahiro Hioki 针对上述挑战，开展了细菌 I.1/I.2 亚家族脂肪酶 Lif 依赖性的系统性研究。研究成果发表在《BMC Genomics》，为解析脂肪酶与 Lif 的协同进化机制及拓展工业可用酶资源提供了重要依据。
研究人员主要采用了以下关键技术方法：首先，通过系统发育分析，以已知 I.1/I.2 亚家族脂肪酶序列为查询，从 NCBI 数据库中筛选出 10218 条同源序列，经聚类和基因组序列过滤后得到 314 条代表性序列，构建系统发育树以分析进化关系；其次，利用隐马尔可夫模型（HMM）结合基因组分析，在脂肪酶基因上下游 5kb 范围内及全基因组中搜索 Lif 基因的存在情况，定义 “邻近 Lif”（Neighbor Lif）和 “远端 Lif”（Remote Lif）；最后，通过序列比对、蛋白质结构预测（如 ColabFold）及异源表达实验（如大肠杆菌表达 PliLip），解析 Lif 依赖性相关的序列特征和结构基础。
研究结果
1. Lif 共存分析与系统发育树整合
通过分析 314 条脂肪酶序列的基因组，发现 246 条脂肪酶与邻近 Lif 共存，33 条与远端 Lif 共存，33 条无 Lif 基因（No Lif）。系统发育树显示，所有已知 Lif 非依赖型脂肪酶均聚集在独立的 P. fragi/P. vulgaris 分支，且该分支脂肪酶均无典型分泌信号（Secretory signal），也不保守形成分子内二硫键（如 C183-C235），但保守存在 E225 等维持结构稳定的氨基酸残基。
2. 序列特征与 Lif 相互作用机制解析
对比 P. fragi/P. vulgaris 分支与其他 I.1 亚家族脂肪酶的序列，发现前者缺乏与 Lif 相互作用的关键残基（如 Y3、A69、R274、N278），这些残基在依赖型脂肪酶中通过氢键或疏水作用与 Lif 结合。此外，P. fragi/P. vulgaris 分支中 E113-E225-S235 形成的氢键网络，可能替代 Lif 参与活性中心的稳定。
3. 新型 Lif 非依赖型脂肪酶分支的发现
鉴定出 Pseudoalteromonas shioyasakiensis 分支，其脂肪酶虽含有分泌信号，但基因组中无 Lif 基因。异源表达实验证实，该分支的 PliLip 在大肠杆菌中可独立激活，表明其为新型 Lif 非依赖型脂肪酶。该分支在进化树上与 P. fragi/P. vulgaris 分支分离，且存在独特的序列特征（如 P86 位谷氨酰胺替代脯氨酸），提示 Lif 非依赖性可能通过不同分子机制演化而来。
研究结论与意义
本研究建立了一种基于基因组 Lif 基因存在性和系统发育特征的脂肪酶 Lif 依赖性预测方法，首次在 I.1 亚家族中发现除 P. fragi/P. vulgaris 分支外的新型 Lif 非依赖型脂肪酶分支（P. shioyasakiensis 分支），并揭示了 Lif 非依赖性的关键分子特征（如缺乏 Lif 互作残基、独特的结构稳定机制）。这些发现不仅拓展了工业可用 Lif 非依赖型脂肪酶的多样性，为简化异源表达流程、降低生产成本提供了新靶点，还为深入理解脂肪酶与分子伴侣（Chaperone）的协同进化机制提供了重要线索。未来，基于本研究提出的序列标志（如 E113、E225、Y3 等残基），可进一步开发高效的 Lif 依赖性预测工具，加速细菌脂肪酶的定向改造和功能挖掘，推动其在绿色化学、生物催化等领域的广泛应用。
