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该研究聚焦大肠杆菌（E. coli）温和噬菌体，分离出 33 株并构建单溶原菌库，发现多数溶原菌可防御其他噬菌体，且防御效能受生长条件和宿主遗传背景影响。通过迭代缺失策略鉴定出 17 个原噬菌体编码的抗噬菌体防御系统，其中 5 个为毒素 - 抗毒素（TA）模块，揭示了噬菌体间相互作用的多样性及原噬菌体在细菌免疫中的重要性。
引言
噬菌体是细菌的病毒天敌，其与细菌的长期博弈催生了细菌多样的免疫系统，如 CRISPR-Cas 和限制修饰（RM）系统等。温和噬菌体可通过溶原周期整合到宿主染色体成为原噬菌体，不仅与宿主共存，还能编码防御系统阻止其他噬菌体感染，从而保护宿主。尽管已有大量抗噬菌体防御系统被鉴定，但针对温和噬菌体的防御机制研究较少，且多数研究集中于裂解性噬菌体。本研究旨在挖掘大肠杆菌温和噬菌体携带的抗温和噬菌体防御系统。
温和噬菌体的分离与特性
研究从 52 株大肠杆菌 ECOR 菌株中诱导并分离出 33 株温和噬菌体，构建了包含 42 株噬菌体的文库，其中多数为 λ 样噬菌体。这些噬菌体基因组存在广泛的重组现象，如 ?R5.2 的裂解区域由宿主基因组中相距 1 Mb 以上的三个原噬菌体区域重组而成。通过 PHASTER 预测发现，实验分离的噬菌体与软件预测的原噬菌体存在差异，提示软件预测可能存在过 calling 现象，且实验分离受宿主菌株和诱导方法限制。
噬菌体间相互作用的背景依赖性
通过全噬菌体防御相互作用矩阵分析发现，多数溶原菌至少能防御一种其他噬菌体，防御表型包括噬斑形成效率（EOP）降低和噬斑尺寸减小。同源免疫（由原噬菌体阻遏蛋白介导）是常见防御机制，但存在不对称相互作用，如 ?R5.2 可逃避其他同源阻遏蛋白的防御。此外，防御效能显著受宿主遗传背景（如 ECOR13 与 K-12 菌株）和生长条件（如 LB 与 M9 培养基、37℃与 30℃）影响，同一系统在不同背景下表现出不同防御强度，甚至仅在特定条件下发挥作用。
原噬菌体编码的抗噬菌体防御系统鉴定
利用迭代缺失策略，在 λ 样噬菌体中鉴定出 17 个防御系统，其中 13 个为新发现。这些系统分布于噬菌体基因组的多个区域，包括裂解区和结构区，且在细菌门中广泛分布，多数与原噬菌体区域相关。通过转录组分析发现，部分防御系统在溶原期低表达或不表达，提示转录水平并非唯一调控因素。克隆实验表明，多数系统在异源宿主中可重现防御表型，但表达水平和调控差异可能导致效能变化。
防御系统的功能与机制
已鉴定的防御系统包括已知的 Nun、HK97 Gp15 等，以及新型系统如含 KilA-N 结构域的蛋白和 DUF（功能未知结构域）蛋白。其中 5 个系统为 TA 系统，毒素包括 HipA、YafO、HicA、PanT 和 GNAT-EVE 融合蛋白。例如，HipAD 系统通过丝氨酸 / 苏氨酸激酶活性抑制翻译，YafO 作为 mRNA 核酸酶发挥作用，HicABC 三组分系统依赖伴侣蛋白 HicC 感知噬菌体感染。这些 TA 系统的毒素保守性高于抗毒素，提示抗毒素可能在噬菌体压力下快速进化。
讨论与展望
本研究揭示了温和噬菌体作为细菌免疫系统重要来源的潜力，发现大量新型抗温和噬菌体防御系统，拓展了对噬菌体 - 噬菌体相互作用的理解。防御系统的背景依赖性可能与宿主因子或表达调控差异有关。尽管研究限于大肠杆菌，但其表明其他细菌物种中可能存在更丰富的防御系统。未来研究可进一步探索防御系统的分子机制、自我免疫机制及在不同生态环境中的分布，为开发新型抗菌策略提供思路。
