冷冻轨道阱二次离子质谱揭示RNA-脂质纳米颗粒中分子取向与分层结构的突破性研究

本研究通过开发冷冻轨道阱二次离子质谱(Cryo-OrbiSIMS)技术，解决了RNA-脂质纳米颗粒(LNP)表面分子组成与空间分布难以表征的难题。研究人员建立冷冻样品制备方法，结合冷冻透射电镜(Cryo-TEM)形貌表征，首次实现LNP中DMG-PEG2k分子取向测定及RNA与脂质组分的深度分布解析，为优化核酸递送系统提供了关键分析方法学突破。

　　

在生物医药领域，脂质纳米颗粒(LNP)作为RNA递送载体已成功应用于新冠mRNA疫苗，但其递送效率仍受限于内体逃逸率不足2%的关键瓶颈。这种效率低下与LNP内部分子排列方式密切相关——就像拼装错误的乐高积木无法发挥应有功能，脂质分子的空间取向错误可能导致药物释放失效。然而，现有技术如中子散射(SANS)需要氘标记，冷冻电镜(Cryo-EM)缺乏分子识别能力，X射线散射(SAXS)仅能获得整体相结构，都难以揭示LNP各组分的真实三维分布。这种"黑箱"状态严重阻碍了下一代核酸药物的理性设计。

英国诺丁汉大学联合Sail Biomedicines的研究团队在《Communications Chemistry》发表创新成果，开发出冷冻轨道阱二次离子质谱(Cryo-OrbiSIMS)深度剖析技术，首次实现对天然状态下LNP分子分层结构的纳米级解析。该技术结合20 keV Ar₃₀₀₀⁺团簇离子溅射与高分辨Orbitrap检测器，在-170°C冷冻条件下保持样品天然结构，通过特征碎片离子追踪各组分分布。研究采用含mRNA的模型LNP体系，包含可电离脂质Dlin-MC3-DMA、辅助脂质DSPC、胆固醇及PEG化脂质DMG-PEG_2k，通过冷冻透射电镜验证颗粒形态后，进行分子深度剖析。

关键技术包括：1) 自主开发的冷冻样品制备流程，实现Cryo-TEM与Cryo-OrbiSIMS同一样品的关联分析；2) Ar₃₀₀₀⁺团簇离子束深度剖析，质量分辨率达240,000；3) 基于特征碎片离子（如C₃₁H₅₉O₄⁺代表DMG、Na[O-CH₂-CH₂]_x⁺代表PEG）的空间分布重建分子排列。

Cryo-OrbiSIMS分子剖面：DMG-PEG

通过对比PEG与DMG碎片的深度分布，发现PEG信号在表面最高并随深度递减，而DMG碎片（如C₁₄H₂₇O₂⁺）在4-7 nm处与PEG曲线相交，证实DMG-PEG_2k的PEG链向外、脂链向内的经典取向。该结果与中子散射测得的4 nm PEG层厚度高度吻合，为方法可靠性提供佐证。腺嘌呤(C₅H₆N₅⁺)信号在8 nm处达到平台，揭示RNA核心位置。

可电离脂质、辅助脂质与胆固醇

DSPC在表面和核心均有分布，而可电离脂质Dlin-MC3-DMA呈现双峰分布：在表面区域(<3 nm)和核心区(>6 nm)富集，暗示其可能参与形成分隔PEG层与RNA核心的疏水屏障。胆固醇[M-OH]⁺离子在表面最丰富，表明其羟基朝向亲水区，这种取向与纯胆固醇晶体研究一致，证实小分子取向检测的可行性。

这项研究建立了首个实验室级、免标记的LNP原位分析方法，其优势体现在：1) 无需氘标记或预设模型，可分析天然配方；2) 单次实验即可获得分子组成、空间分布与取向信息；3) 分析通量达20个剖面/小时，适合高通量配方筛选。该方法不仅验证了经典LNP结构模型，更发现可电离脂质的表面富集现象，为理解其促进内体逃逸的机制提供新视角。研究揭示的PEG层厚度不均一性(4-8 nm)可能是导致LNP批次差异的关键因素，这对生产工艺控制具有直接指导意义。

技术突破方面，冷冻条件下次级离子产率提升达10,000倍，结合团簇离子束减少分子损伤，使高保真深度剖析成为可能。未来通过建立有机分子标准品库，该方法有望实现生物界面分子定量，为纳米药物"结构-活性"关系研究开辟新途径。随着AI辅助LNP设计的发展，这种高分辨分子分布数据将极大提升算法预测精度，加速下一代核酸药物的临床转化。