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本研究聚焦牛溶血曼氏杆菌（Mannheimia haemolytica，Mh），通过构建荚膜生物合成基因簇缺失突变株（?cap）和假定黏附素基因缺失突变株（?adh123），在犊牛攻毒模型中探究其定植动态，揭示荚膜和黏附素在鼻咽喉定植中的作用，为牛呼吸道疾病（BRD）防控提供新方向。
研究背景与目的
牛溶血曼氏杆菌（Mannheimia haemolytica，Mh）是牛呼吸道疾病（bovine respiratory disease，BRD）的主要病原体，其荚膜和表面黏附素被认为与呼吸道黏膜的黏附定植相关。本研究通过构建 Mh 血清 1 型的荚膜生物合成基因簇缺失突变株（?cap）和假定黏附素基因缺失突变株（?adh123），利用犊牛攻毒模型，结合牛疱疹病毒 1 型（bovine herpesvirus-1，BHV-1）感染，探究不同突变株在牛上呼吸道的定植能力及动态变化，为 BRD 的防控策略提供理论依据。
材料与方法
- 突变株构建：利用温度敏感型质粒 pCT109GA189-Kan 构建?cap 和?adh123 突变株，通过 PCR 和全基因组测序验证基因缺失的准确性。
- 动物分组与攻毒：12 头荷斯坦 - 安格斯杂交犊牛随机分为两组：Sham-Mh-BHV-1（SMB 组，先接种 Mh 再接种 BHV-1）和 BHV-1-Mh-Sham（BMS 组，先接种 BHV-1 再接种 Mh）。攻毒菌液为野生型（WT）、?cap 和?adh123 的混合菌悬液。
- 样本采集与检测：每周采集鼻拭子和腭扁桃体洗液，通过细菌培养和多重 PCR 鉴定各菌株的定植情况。 necropsy 时采集肺和腭扁桃体组织，进行细菌培养和组织病理学分析。
结果
- 定植能力差异：?cap 突变株在接种 1 天后即未被检测到，表明荚膜缺失导致其无法长期定植。而?adh123 突变株在鼻咽部和腭扁桃体的定植水平显著高于野生型（P < 0.0001），尤其在 BHV-1 感染后，其定植优势更明显。
- BHV-1 感染的影响：BMS 组（先感染 BHV-1）在早期（1 dpi）的鼻部分泌物中 Mh 检出率更高，但两组的总细菌载量无显著差异。BHV-1 感染可能通过损伤呼吸道上皮，促进 Mh 的黏附定植。
- 组织分布与病理变化：?adh123 突变株在腭扁桃体中的定植比例显著高于野生型，而肺部仅在 BMS 组的 3 头犊牛中检测到 Mh，其中?adh123 占主导。组织病理学显示，感染犊牛的扁桃体和肺组织出现中性粒细胞浸润、坏死等炎症反应。
讨论
- 荚膜的作用：荚膜不仅是免疫逃避的关键因子（通过抵抗吞噬和补体介导的杀伤），还对 Mh 的长期定植至关重要。?cap 突变株因缺乏荚膜，迅速被宿主免疫系统清除。
- 黏附素的双重作用：尽管假定黏附素基因缺失（?adh123），该突变株的定植能力反而增强，可能与其他黏附因子的补偿表达或细菌表面结构改变有关。这提示黏附素可能在定植初期促进黏附，但长期存在时可能成为宿主免疫识别的靶点。
- 病毒 - 细菌协同作用：BHV-1 感染通过破坏呼吸道黏膜屏障，增加宿主对 Mh 的易感性。先感染 BHV-1（BMS 组）的犊牛中，野生型 Mh 的短期定植水平更高，而?adh123 突变株在两种感染顺序中均表现出定植优势。
- 疫苗开发潜力：?adh123 突变株的高定植能力和减毒特性，可能使其成为黏膜疫苗的候选株，通过诱导局部免疫反应预防 BRD。未来需进一步验证其免疫原性和保护效果，并探索与其他毒力因子缺失株的联合应用。
结论
本研究证实，荚膜是 Mh 在牛上呼吸道长期定植的必需因子，而黏附素基因缺失可增强细菌的定植能力。BHV-1 感染通过损伤呼吸道上皮，促进 Mh 的黏附与扩散。这些发现为 BRD 的发病机制提供了新见解，并为开发基于黏附素或荚膜的新型防控策略（如减毒活疫苗）奠定了基础。
