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该研究开发了基于新一代测序技术的肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae）综合基因分型工作流程，通过七管 PCR 扩增、混合测序及从头组装，可同时检测 p1、orf6、多位点序列类型（MLST）、大环内酯类耐药相关 23S rRNA 基因突变及 p1 型 1 谱系单核苷酸多态性（SNP），为分子流行病学研究提供高效工具。
研究背景与目的
肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae）的基因分型在分子流行病学中至关重要，传统方法需并行多种实验，而全基因组测序因 p1 基因重复元件问题难以通过短读长测序完成完整分型。本研究开发一种基于扩增子测序的简化工作流程，旨在实现对肺炎支原体主要基因分型方案的全覆盖，包括 p1、orf6、多位点序列类型（MLST）、大环内酯类耐药相关 23S rRNA 基因突变及 p1 型 1 谱系单核苷酸多态性（SNP）的同步检测。
材料与方法
菌株与样本
收集 2016-2023 年东京五家医院的 40 株肺炎支原体临床分离株，经培养、单菌落分离及环介导等温扩增（LAMP）验证后用于研究。
扩增子测序流程
采用七管 PCR 扩增目标区域：2 管用于 p1 操纵子，1 管用于 23S rRNA 基因，3 管用于 MLST 的 8 个位点（ppa、pgm、gyrB、gmk、glyA、atpA、arc、adk），1 管用于 SNP 分型的 3 个区域（MP295、MP607、MP678）。扩增产物混合纯化后，通过 Illumina MiSeq 平台进行双端测序（2×250 bp），经质量控制、引物修剪后，利用 Spades 软件进行从头组装获得 contig 序列。
计算机模拟基因分型
通过 MegaBlast 算法比对参考序列，检测 23S rRNA 基因及 SNP 位点突变；利用 MEGA7 软件构建邻接树分析 p1 操纵子变异；通过 MLST 程序确定序列类型（ST）。
全基因组测序与系统发育分析
采用 Illumina 短读长与 Oxford Nanopore 长读长测序结合的杂交组装技术，获得完整基因组序列。利用 Snippy、Gubbins 等工具进行 SNP 分析及系统发育树构建，排除重组位点影响，明确菌株遗传关系。
结果
扩增子组装与基因分型准确性
40 株菌株均成功获得所有目标区域 contig，DNA 输入浓度（0.094-106 μg/mL）不影响结果。MLST 中 pgm 位点因片段较长采用两管扩增，组装后可合并为完整序列。基因分型结果与全基因组测序及公共数据库比对一致，验证了工作流程的准确性。
新型变异与基因型分类
在 3 株的 RepMP4、4 株的 RepMP2/3 及 21 株的 orf6 区域发现与参考序列不完全一致的变异，经全基因组杂交组装验证，这些变异为自发突变而非重组，部分序列因核苷酸差异在 GenBank 中无匹配项，但仍可归类至已知基因型。
系统发育与基因型关联
p1 型 1 谱系可分为 T1-1、T1-2、T1-3、T1-3R 等分支，其中 T1-3R 与大环内酯类耐药显著相关；p1 型 2 谱系的分支则与 p1、orf6 及 MLST 类型组合密切相关。研究结果与既往报道一致，且通过基因型组合可精准推断菌株的遗传关系，如中国 EC2 菌株可能属于 p1 型 2c/ST14 型。
讨论
传统 PCR-RFLP 方法因分辨率有限可能漏检新型变异，而本研究的扩增子测序可实现 p1 操纵子的序列级检测，避免了 RFLP 的局限性。与既往日本研究相比，本研究中 p1 型 2c 菌株的优势 ST 为 ST14 而非 ST33，可能与采样区域差异及 MLST 引物设计覆盖更广区域有关。由于部分 ST 差异仅由单个 SNP 引起，需结合多种分型方法以准确评估菌株遗传关系。
研究局限性包括系统发育树的地域偏倚（主要基于东亚菌株）及临床样本直接扩增需嵌套 PCR 的限制。未来可通过优化针对 p1 操纵子的嵌套 PCR 方案拓展应用。
结论
本研究建立的多重扩增子测序工作流程，可高效、准确地实现肺炎支原体多维度基因分型，为分子流行病学研究及新型基因型检测提供了通用平台，且具备灵活纳入新分型标记的潜力，有望成为未来肺炎支原体系统发育研究的标准化方案。
