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本研究开发高效经济的关联光镜 - 电镜（CLEM）工作流程，通过激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）结合透射电镜（TEM），利用 FM1-43 染色和 OsO?蒸汽负染，实现纳米级 EVs 形态与荧光信号关联分析，为真菌 EVs 及相关纳米结构研究提供可靠工具。
研究背景与技术挑战
胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）作为由细胞释放的膜包裹纳米颗粒（30-1000 nm），在真菌致病、耐药及免疫调节中具关键作用。传统激光扫描共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscopy, LSCM）受衍射极限限制（分辨率约 250 nm），难以清晰成像 < 200 nm 的 EVs；透射电镜（Transmission Electron Microscopy, TEM）虽具纳米级分辨率（<1 nm），但样本制备复杂且易产生假象。关联光镜 - 电镜技术（Correlative Light and Electron Microscopy, CLEM）结合两者优势，可通过荧光信号定位超微结构，然现有方法多依赖昂贵设备，且在真菌 EVs 研究中应用空白。
材料与方法
EVs 分离与病毒纯化
从粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）培养滤液中通过差速离心分离 EVs：依次经 3000 rpm 离心 30 min、10000 rpm 离心 1 h 去除细胞碎片，最终 100,000×g 超速离心 2 h 收集 EVs。同时，从感染的大麦叶片中纯化雀麦花叶病毒（Brome Mosaic Virus, BMV），通过 FITC 标记其表面氨基，作为荧光对照样本。
CLEM 样本制备与成像
将 EVs 与 5 μM FM1-43（膜特异性荧光染料）及荧光聚苯乙烯微球（1 μm 直径，作为基准标记）混合，滴加至铜网后进行 LSCM 成像。随后采用两种负染色法对比：
- OsO?蒸汽染色：将铜网置于 2% OsO?溶液上方 2-5 cm 处熏蒸 5-30 min，固定 EVs 膜结构并增强电镜对比度；
- 醋酸铀染色：滴加 2% 醋酸铀溶液 60 s 后吸去多余液体。
染色后样本经 TEM 观察，低倍镜（100-700×）定位基准标记，高倍镜（20,000-50,000×）分析 EVs 形态。
图像关联与分析
通过 Adobe Photoshop 叠加 LSCM 与 TEM 图像，以荧光微球及铜网网格为坐标基准，结合 Fiji 软件的均值漂移超分辨率（MSSR）插件提升图像分辨率。统计分析 EVs 直径分布，验证荧光信号与膜结构的关联性。
结果与讨论
CLEM 工作流程验证
开发的五步法 CLEM 流程（染色 - 标记 - 光镜成像 - 电镜染色 - 关联分析）成功实现 EVs 荧光信号与超微结构的精准匹配。LSCM 下 FM1-43 标记的绿色荧光区域，在 TEM 中对应具双层膜结构的囊泡样颗粒，平均直径 43.32±15.56 nm，与文献报道一致。1 μm 荧光微球因表面吸附 EVs，成为高效基准标记，显著提升图像配准效率。
染色方法对比
OsO?蒸汽染色较醋酸铀染色具显著优势：前者通过 “无接触” 熏蒸避免样本移位，保持基准标记位置稳定，且减少液体染色引入的颗粒状假象；后者虽能显示 EVs 结构（平均直径 37.20±13.12 nm），但吸液步骤易导致荧光微球位移，且背景污染明显。
技术优势与应用扩展
该方法无需高端整合显微镜，仅需常规 LSCM 与 TEM 即可实施，成本低廉且操作简便。除真菌 EVs 外，可扩展至病毒颗粒（如 FITC 标记的 BMV）、分泌囊泡及纳米药物载体等研究。结合超分辨率成像或基因编码荧光标记，可进一步提升分析精度。
结论
本研究建立的 CLEM 方案为纳米级生物结构表征提供可靠工具，通过荧光染料与负染色技术的优化组合，实现 EVs 形态与功能的跨尺度关联分析。该方法兼具高效性与经济性，有望在细胞生物学、纳米医学等领域推动 EVs 研究的深入发展。
