鲶鱼养殖池塘中细菌硝化与反硝化基因qPCR检测技术的开发与应用

本研究针对美国鲶鱼养殖产业中氮废物处理的微生物学机制，开发了定量PCR(qPCR)技术靶向检测硝化(amoA/nxrB)与反硝化(napA/nirK)功能基因。通过高通量测序优化引物设计，首次在无过滤系统的土塘环境中证实溶解氧水平显著影响氮循环基因丰度，为高密度养殖水质管理提供了分子监测工具。

　　

ABSTRACT
氮废物对鱼类具有毒性，其去除是水产养殖的关键过程。在鲶鱼产业使用的土塘系统中，浮游植物是氨的主要吸收者，但当氨过量时，细菌的硝化和反硝化作用变得尤为重要。随着养殖强度增加，与氮废物去除相关的细菌群落将变得更加重要。本研究开发了针对鲶鱼养殖池塘中硝化和反硝化途径四个基因的定量PCR(qPCR)检测方法。

IMPORTANCE
鲶鱼养殖是美国规模最大的水产养殖产业。生产在无水体交换或过滤系统的土塘中进行，环境微生物在维持水质特别是氮废物处理方面发挥重要作用。随着养殖强度增加以满足全球人口需求，细菌在氮废物去除中的作用可能变得更加显著。

INTRODUCTION
氮废物去除是任何水产养殖生产系统的关键过程。氨由生物排泄或从沉积物中释放，以非离子氨(NH₃)或铵(NH₄⁺)的形式存在于水中，其比例取决于pH和温度。总氨和亚硝酸盐(NO₂^-)积累会对鱼类和无脊椎动物造成危害。

美国鲶鱼养殖在土塘中进行，其中氮的主要吸收者是浮游植物。随着投喂率增加，浮游植物的承载能力达到极限，氨开始积累，硝化成为重要的氨去除过程。硝化是一个两步过程，可由多种化能自养细菌或古菌完成。

MATERIALS AND METHODS
研究设计了12个实验池塘，其中8个放养杂交鲶鱼，4个作为对照。每周测定总氨氮(TAN)、亚硝酸盐氮(NO₂-N)和硝酸盐氮(NO₃-N)。7月和9月采集沉积物和水样进行DNA提取。

使用24对已发表的引物进行常规PCR，靶向硝化/反硝化相关基因：amoA(5个检测)、napA(2)、narG(2)、nirK(3)、nirS(3)、norB(2)、nosZ(2)、nxrA(1)、nxrB(2)和hzo(2)。PCR产物经牛津纳米孔技术测序，用于qPCR引物设计。

RESULTS
常规PCR结果显示，15/24引物对产生单一预期条带。测序分析确定了最优聚类阈值在91%-96%之间。BLASTN搜索确认了五个靶标(amoA、nxrB、napA、nirK和nosZ)的适当扩增。

成功开发了四个靶标的qPCR检测：amoA、nxrB、napA和nirK。这些检测应用于从低溶解氧、高溶解氧或无鱼(对照)池塘收集的沉积物和水样，显示amoA、nxrB和nirK基因丰度存在显著差异。

在水样中，NO₃-N与三个基因(nxrB、napA和nirK)的丰度呈显著正相关，这些基因编码产生或利用亚硝酸盐的酶。

DISCUSSION
本研究首次开发了使用鲶鱼池塘环境样本的qPCR检测方法，可量化氮氧化和还原基因的丰度。BLASTN结果显示，许多amoA和nxrB序列与Nitrospira spp.最匹配，该属包含一些已知能够完全氨氧化的物种。

研究发现，在活跃投喂的池塘中，氨和亚硝酸盐氧化菌的丰度显著高于对照池塘。硝化检测显示，沉积物中amoA和nxrB拷贝数分别是水中的2.5倍和21倍。反硝化靶标napA在沉积物中的丰度约为水中的3.0倍，但nirK在不同介质间无差异。

这项工作的一个重要限制是所用PCR检测的覆盖范围。许多已发表的PCR检测是基于已知含有这些基因的培养分离株或NCBI中现有的序列设计的，这可能限制了它们对含有这些基因但引物结合区域序列不同的物种的适用性。

未来工作应确定硝化/反硝化细菌是否存在沉积物深度依赖性反应，因为溶解氧浓度应随深度迅速下降，可能导致需氧硝化菌在表层而厌氧反硝化菌在沉积物深处。这些qPCR检测将有助于阐明硝化/反硝化细菌的定植位点和深度、溶解氧浓度和悬浮固体之间的相互作用。