表面敏感光散射显微技术实现单颗粒水平脂质纳米粒的多参数功能表征

这篇研究通过整合表面敏感荧光与无标记散射显微技术及微流控技术，建立了脂质纳米粒（LNP）的单颗粒多参数表征方法，揭示了LNP的理化性质（如尺寸、折射率、载量）与功能行为（如内体条件下膜融合性）的关联。研究发现，传统悬浮态LNP的理化表征无法预测其功能性能，而该技术为优化基因治疗载体设计提供了关键工具。

　　

研究背景

脂质纳米粒（LNP）作为基因治疗载体，其效率受脂质组成、mRNA载量、尺寸和结构等多因素影响。尽管COVID-19 mRNA疫苗已证实LNP的临床潜力，但现有LNP的递送效率普遍低于10%。传统表征方法（如纳米颗粒追踪分析NTA）仅能提供悬浮态LNP的有限参数，难以预测其在细胞内的功能表现。

技术突破

本研究开发了一种结合表面敏感荧光、无标记散射显微技术和微流控的集成平台（Nanolyze?），通过测量LNP在可变折射率介质中的散射信号，量化单颗粒的尺寸（r_LNP）、折射率（n_LNP）和荧光载量（Cy5-mRNA/Rhod-DOPE）。以二氧化硅纳米颗粒（75 nm半径）为参照，利用瑞利-甘斯-德拜（RGD）近似理论解析数据，精度达2 nm（尺寸）和0.003（折射率）。

关键发现

1. 结构异质性：两种LNP（低/高DSPC比例）虽尺寸相近（低DSPC：67±2 nm；高DSPC：80±3 nm），但高DSPC LNP的尺寸分布更宽。折射率分析（n_LNP~1.46）支持LNP内核含25%水分的理论模型。
2. 载量分布：Cy5-mRNA和Rhod-DOPE荧光强度与LNP体积呈立方关系（斜率~3），表明mRNA和标记脂质均匀分布于颗粒内部，而表面标记的Atto-488-PEG则呈平方关系（斜率~2），验证了PEG脂质的外壳定位。
3. 功能差异：低DSPC LNP在pH 6.0条件下膜融合率（25%）显著高于高DSPC LNP（4%），与细胞实验中hEPO表达差异一致，证实DSPC表面覆盖度抑制内体逃逸。

机制解析

通过pH触发的SLB（支撑脂质双层）融合实验发现：

• 融合事件伴随散射信号骤降（>40%）和Rhod-DOPE荧光减弱（72%案例），提示脂质转移至SLB。
• 部分LNP的Cy5-mRNA荧光增强1.5倍，反映mRNA在膜附近的局域化浓缩。
• 未发现尺寸、折射率或载量与融合行为的直接关联，凸显功能表征的必要性。

应用前景

该技术突破了传统悬浮态表征的局限，为LNP的理性设计提供新维度。未来可结合干涉散射（iSCAT）和原子力显微技术（AFM），进一步探索蛋白冠形成和纳米力学特性对LNP功能的影响。

（注：全文数据均来自原文实验，未添加主观推断。）