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口腔鳞状细胞癌（OSCC）治疗存在副作用问题，亟需有效化疗药物。本研究探讨柠檬素对 OSCC 细胞的抗癌作用，发现其可诱导细胞周期阻滞于 G2/M 期、 caspase 相关凋亡，抑制 AKT/ERK/JNK 磷酸化等，为 OSCC 治疗提供新方向。
口腔癌是全球公共健康的重大威胁，其中口腔鳞状细胞癌（OSCC）占所有口腔癌病例的 96%。多数 OSCC 患者确诊时已处于 III 或 IV 期，且年轻患者发病率呈上升趋势。当前主要治疗手段如放疗和化疗虽有效，但对健康组织和细胞存在显著副作用，限制了其应用，因此开发更安全有效的抗癌药物迫在眉睫。
来自印度 Maitocon Laboratory 和中国台湾彰化基督教医院口腔癌研究中心等机构的研究人员，针对天然化合物柠檬素（limocitrin）在 OSCC 中的抗癌作用及机制展开研究。结果表明，柠檬素可通过调控多条信号通路诱导 OSCC 细胞凋亡，为口腔癌治疗提供了新的潜在策略。该研究成果发表于《Scientific Reports》。
研究人员主要采用了以下关键技术方法：
- 细胞增殖与毒性检测：通过 CCK-8 assay 和集落形成实验，评估柠檬素对 SCC-9 和 SCC-47 细胞的增殖抑制作用。
- 流式细胞术：包括细胞周期分析、线粒体膜电位检测和 Annexin-V/PI 双染法，用于分析细胞周期分布、凋亡及线粒体功能变化。
- 蛋白质印迹法（Western blot）：检测凋亡相关蛋白（如 caspase-3、Bcl-2）、细胞周期蛋白（cyclin E1、CDK2）及信号通路蛋白（p-AKT、p-ERK）的表达水平。
- RNA 干扰实验：利用 siRNA 敲低 XIAP、cIAP1 等基因，探究其在柠檬素诱导凋亡中的作用。
研究结果
1. 柠檬素抑制 OSCC 细胞增殖
CCK-8 和集落形成实验显示，柠檬素以浓度和时间依赖的方式显著抑制 SCC-9 和 SCC-47 细胞的活力及克隆形成能力，表明其具有强效抗增殖作用。
2. 柠檬素诱导细胞凋亡及线粒体功能异常
流式细胞术显示，柠檬素处理后细胞线粒体膜电位降低，促凋亡蛋白 Bax、Bak 表达增加，抗凋亡蛋白 Bcl-2、Bcl-xL 减少。同时，死亡受体 Fas、DR5 及诱骗受体 DcR2/DcR3 表达上调，提示柠檬素通过内源性线粒体途径和外源性死亡受体途径诱导凋亡。
3. 柠檬素阻滞细胞周期于 G2/M 期
细胞周期分析表明，柠檬素处理后 G2/M 期细胞比例显著增加，伴随 cyclin E1、E2 及 CDK2、CDK4、CDK6 表达下调，p21 表达上调，提示其通过抑制细胞周期蛋白和激酶活性，诱导 G2/M 期阻滞。
4. 柠檬素抑制 AKT/ERK/JNK 信号通路
Western blot 结果显示，柠檬素可剂量依赖性地抑制磷酸化 AKT、ERK1/2 和 JNK 的表达，而磷酸化 p38 表达上调。使用 ERK 抑制剂 U0126 预处理后，凋亡相关蛋白（cleaved caspase-3、-8、PARP）表达进一步增加，表明 ERK 通路在柠檬素诱导凋亡中起关键作用。
5. XIAP 在柠檬素诱导凋亡中的作用
蛋白质芯片和 Western blot 显示，柠檬素下调 XIAP、cIAP1 和 HSP27 的表达。siRNA 敲低 XIAP 后，联合柠檬素处理可显著增强 cleaved PARP、caspase-3 和 - 8 的表达，提示柠檬素通过抑制 XIAP 促进凋亡。
研究结论与意义
本研究证实，柠檬素通过多途径发挥抗癌作用：
- 诱导 OSCC 细胞周期阻滞于 G2/M 期，抑制细胞增殖；
- 激活内源性线粒体凋亡途径和外源性死亡受体途径，诱导 caspase 依赖性凋亡；
- 抑制 AKT/ERK/JNK 信号通路，增强凋亡效应；
- 下调 XIAP 等凋亡抑制蛋白，协同促进细胞死亡。
这些发现不仅揭示了柠檬素在 OSCC 中的作用机制，还为开发低毒高效的天然抗癌药物提供了理论依据。鉴于当前 OSCC 治疗的局限性，柠檬素有望成为潜在的治疗候选药物，为口腔癌患者带来新希望。未来研究可进一步探索其在体内模型中的疗效及临床转化潜力。
