P65激活通过调控Cx3cr1+/Cdk1+小胶质细胞亚群加剧脑缺血再灌注损伤的神经炎症机制

本研究针对脑缺血再灌注（I/R）损伤中神经炎症调控机制不明的关键问题，通过单细胞转录组分析结合MCAO小鼠模型和OGD/R细胞实验，揭示P65（RELA）作为NF-κB通路核心转录因子，驱动Cx3cr1+/Cdk1+小胶质细胞亚群促炎表型转化，加剧神经元凋亡。抑制P65磷酸化可显著减轻炎症反应，为缺血性卒中治疗提供新靶点。

　　

脑卒中作为全球第二大死亡原因，其缺血性亚型占70%以上。尽管再灌注治疗可恢复血流，但随之而来的脑缺血再灌注（I/R）损伤常导致更严重的神经功能缺损。这种"二次打击"现象的核心在于神经炎症的过度激活，而小胶质细胞作为中枢神经系统固有免疫细胞，在此过程中扮演着双刃剑角色。既往研究虽证实小胶质细胞表型转化与卒中预后相关，但驱动其促炎亚群分化的关键分子机制尚未阐明，特别是转录调控网络的时空特异性仍属空白。

南京医科大学附属第一医院联合南通大学护理与康复学院的研究团队，通过整合5个公共数据库（GSE227651、GSE104036等）的单细胞及转录组数据，结合小鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）模型和氧糖剥夺/复氧（OGD/R）细胞模型，首次系统揭示了转录因子P65（RELA）通过调控Cx3cr1⁺/Cdk1⁺小胶质细胞亚群加剧神经炎症的分子机制。该成果发表于《Scientific Reports》，为靶向干预卒中后神经炎症提供了理论依据。

研究采用单细胞转录组分析（Seurat流程）、轨迹推断（Monocle2和CytoTRACE）、时间序列基因聚类（Mfuzz）等生物信息学方法，结合MCAO小鼠行为学评估、激光散斑血流成像、TTC染色等体内实验，以及OGD/R处理的BV2小胶质细胞系与SH-SY5Y神经元共培养等体外模型，通过Western blot、qPCR和免疫荧光等多维度验证机制。

单细胞解析卒中后脑部细胞动态图谱
分析显示MCAO术后1-7天的小鼠缺血半球存在10类细胞群，其中小胶质细胞（C1qa⁺/C1qb⁺）和星形胶质细胞比例显著增加，神经元数量锐减。KEGG富集揭示HIF-1、NF-κB和吞噬体通路激活，GO分析显示小胶质细胞在免疫受体活性和转录共调控方面得分最高，确立其作为神经炎症核心效应器的地位。

时间分辨转录组揭示P65枢纽作用
动态基因表达聚类发现，MCAO后6小时启动组织修复相关基因，12小时出现mRNA加工通路上调，24小时则显著激活天然免疫应答。关键的是，转录因子活性评分显示NF-κB家族成员P65和p50在多个时间点持续高活性，且在人类卒中患者外周血单核细胞数据中同样观察到RELA上调，证实其跨物种保守性。

小胶质细胞亚群特异性调控机制
将小胶质细胞细分为9个亚群后，发现Cx3cr1⁺和Cdk1⁺亚群在MCAO后1-3天比例显著增加。轨迹分析表明这些亚群集中于P65活性最高的State 1，其分化相关基因显著富集于Toll样受体和TNF信号通路。体内实验证实tMCAO小鼠梗死区小胶质细胞胞体增大、分支缩短，且IBA1⁺/P-P65⁺共标比例升高，伴随IL-6、TNF-α等促炎因子释放增加。

P65抑制的神经保护效应
使用特异性抑制剂JSH23阻断P65磷酸化后，OGD/R处理的BV2细胞炎症因子分泌减少，其条件培养基诱导的SH-SY5Y神经元凋亡率显著降低。这一发现为"通过调控转录因子活性干预小胶质细胞极化"的治疗策略提供了直接证据。

该研究创新性地绘制了卒中后小胶质细胞亚群的时空动态图谱，阐明P65通过驱动Cx3cr1⁺/Cdk1⁺亚群促炎转化加剧神经损伤的机制。尽管存在未探索P65抑制长期效应等局限，但研究提出的"转录因子-细胞亚群-炎症级联"调控框架，为开发针对卒中后神经炎症的精准干预策略奠定了理论基础。未来研究可进一步探索P65与其他通路（如MAPK）的交互作用，以及其在神经修复期的潜在功能转换。