靶向RUNX1-ETO NHR2域的非电荷型7.44类似物：增强抗白血病活性的新策略

为解决t(8;21)急性髓系白血病(AML)中RUNX1-ETO融合蛋白的靶向治疗难题，研究人员通过配体虚拟筛选和生物物理验证，发现非电荷型小分子M23、M27和M10能特异性抑制NHR2域四聚化，其细胞活性较先导化合物7.44提升5-10倍，且具有优异膜渗透性。该研究为开发低毒性AML靶向药物提供了新候选分子。

　　

急性髓系白血病(AML)是一种恶性血液肿瘤，其中t(8;21)染色体易位导致的RUNX1-ETO融合蛋白是12%原发AML和40% M2亚型的驱动因素。这种融合蛋白通过NHR2域四聚化阻断髓系分化，传统化疗对老年患者毒性大且复发率高。尽管FDA已批准部分AML靶向药，但针对t(8;21)的特异性抑制剂仍属空白。先前发现的化合物7.44虽能抑制NHR2四聚化，但其生理pH下的负电荷特性导致膜渗透性不足，制约了临床转化潜力。

德国杜塞尔多夫大学等机构的研究团队通过配体虚拟筛选(FastROCS)、细胞活力实验(IC₅₀ 33-77μM)、生物物理验证(微尺度热泳动K_D,app 39-114μM)及分子动力学模拟，鉴定出非电荷型化合物M23、M27和M10。这些分子通过干扰W498/W502等热点残基相互作用，使RUNX1-ETO阳性细胞凋亡并促进分化，且预测具有优异药代动力学特性。相关成果发表于《Scientific Reports》。

主要技术方法
研究采用配体虚拟筛选从588万化合物库中初筛30个候选分子；通过CellTiter-Glo法测定细胞活力，饱和转移差示核磁共振(STD-NMR)验证靶点结合；纳米差示扫描荧光(nanoDSF)检测蛋白热稳定性变化；微尺度热泳动(MST)定量结合亲和力；分子动力学模拟(MD)解析结合表位；NMR滴定测定pK_a值预测膜渗透性。

研究结果

配体虚拟筛选
以7.44为模板筛选eMolecules/ZINC15数据库，基于Tanimoto-Combo评分(>1.3)和药效团匹配性，选出30个分子量<400 Da的候选物。M23、M10和M27因含1,3-苯并二氧戊环类似结构被优先选择。

细胞活力与靶点验证
在SKNO-1细胞中，M23显示最强抑制活性(IC₅₀ 62.14μM)。STD-NMR证实所有活性化合物均与NHR2结合，而阴性对照M6无信号。KASUMI(RUNX1-ETO+)细胞对M23的敏感性较K562(RUNX1-ETO-)高2倍，证实靶向特异性。

生物物理特性分析
nanoDSF显示M23使NHR2熔解温度降低1.6°C，提示四聚体稳定性破坏。MST测得M23的K_D,app为39μM，虽低于7.44(2.3μM)，但其细胞活性更高，归因于中性电荷提升的膜渗透性。STD-NMR表位图谱显示M23的异丙基与NHR2螺旋间存在特异性相互作用。

分子机制解析
MD模拟揭示M23主要结合于两个表位：表位I(13.2%占有率)与7.44重叠，涉及W498/W502；表位II(10.1%)位于蛋白互作界面。M23的1,5-苯并二氧杂环结构对靶标结合至关重要。

生物学功能验证
M23在CFU实验中抑制RUNX1-ETO阳性细胞集落形成，效力较7.44强10倍。其通过诱导亚G1期阻滞和caspase-3/7激活促进凋亡，并上调CD11b表达推动髓系分化。

药代动力学预测
pK_a测定显示M23(pK_a 6.6)在生理pH下基本不带电。MD模拟预测其中性形态膜渗透性达7.0×10^-6 cm/s，且无HERG通道抑制风险，符合Lipinski规则。

结论与意义
该研究突破性地将7.44的羧基替换为疏水基团，获得首个非电荷型NHR2抑制剂系列。M23通过结合NHR2四聚界面关键残基，以亚微摩尔级效力逆转RUNX1-ETO的致癌功能，其膜渗透性和安全性特征显著优于肽类抑制剂。这一发现不仅为t(8;21) AML提供了可口服的先导化合物，更开创了通过调控转录因子寡聚化治疗白血病的新策略。未来可探索与阿糖胞苷等化疗药的联用方案，或结合表观遗传调节剂实现协同治疗。