N 端半胱氨酸氧化酶底物结合机制的突破性研究：基于 mRNA 展示的环肽支架解析

【编辑推荐】为解析 N 端半胱氨酸氧化酶（NCOs）底物结合机制，研究人员利用 mRNA 展示技术筛选环肽抑制剂，结合晶体学与突变分析，揭示人源 2 - 氨基乙硫醇双加氧酶（ADO）与底物类似物的结合模式，确认 Asp206 为关键催化残基，为低氧疾病药物开发提供结构基础。

　　

低氧（Hypoxia）是多种重大疾病的核心病理特征，如中风、缺血性心脏病和癌症，这些疾病在发达国家的致死率和致残率居高不下。生物体通过复杂的分子机制适应低氧环境，其中 N 端半胱氨酸氧化酶（N-terminal cysteine oxidases, NCOs）作为氧气传感器，通过 N - 降解途径（N-degron pathway）调控含 N 端半胱氨酸（Nt-Cys）蛋白的稳定性，在低氧响应中扮演关键角色。然而，NCOs 与底物结合的结构信息长期缺失，严重制约了其作为治疗靶点的药物开发，无论是在医学领域针对低氧疾病，还是在农业领域调控作物耐涝性方面，都亟需突破。

为解决这一难题，澳大利亚悉尼大学（The University of Sydney）的研究团队开展了系统性研究。他们利用 mRNA 展示技术（Random nonstandard Peptide Integrated Display, RaPID）筛选出人源 NCO——2 - 氨基乙硫醇双加氧酶（2-aminoethanethiol dioxygenase, ADO）的环肽抑制剂，并以此为支架嫁接底物类似物，成功解析了 ADO 与底物类似物结合的高分辨率晶体结构，揭示了关键结合机制及催化残基功能。该研究成果发表在《Nature Communications》，为理解 NCOs 的作用机制和靶向药物设计提供了里程碑式的结构基础。

研究中采用的核心技术包括：

1. RaPID 技术：一种 mRNA 展示的变体，通过基因重编程引入非标准氨基酸，构建包含超 1012 个环肽的文库，筛选高亲和力抑制剂。

2. 表面等离子体共振（SPR）：用于定量分析环肽与 ADO 的结合亲和力（KD 值）及抑制模式（竞争性 / 非竞争性抑制）。

3. X 射线晶体学：通过钴离子替代铁离子、表面半胱氨酸突变等策略，解析 ADO 与环肽 - 底物类似物复合物的晶体结构（分辨率达 1.60–1.74 ?）。

4. 分子动力学（MD）模拟：验证底物类似物与金属中心的结合模式在生理条件下的稳定性。

5. 定点突变与酶活测定：确认关键残基（如 Asp206）在催化中的作用。

研究结果

1. 环肽抑制剂的筛选与表征

通过 6 轮 RaPID 筛选，富集到 8 个高亲和力环肽（CP1–CP8），其中 CP1、CP5、CP6、CP8 的 KD 值低至 5–66 nM。功能验证显示，这些环肽通过竞争性（如 CP1、CP5）或非竞争性（如 CP6、CP8）模式抑制 ADO 活性，IC50 值在单 - digit μM 范围。SPR 竞争实验证实，环肽与天然底物 RGS5 竞争性结合 ADO 活性位点，表明其作用于底物结合区域。

2. CP6 的抑制机制与晶体结构解析

CP6 与 ADO 的共晶结构（PDB: 9DXU）显示，环肽以反平行 β- 折叠构象结合于 ADO 的双股 β- 螺旋（DSBH）核心，阻断活性位点入口。关键相互作用包括 CP6-Trp7 与 ADO-Tyr87 的 π- 堆积、C 端酰胺与 ADO-Trp257 的 π- 堆积，以及 Arg12 与 ADO-Gln252、Ala253、Phe256 的氢键。此外，CP6-Phe6 通过 ADO-Glu92 介导的氢键网络，将催化残基 Asp206 拉离金属中心，揭示非竞争性抑制的结构基础。

3. 底物类似物结合模式与关键残基验证

以 CP6 为支架，在 L8 位点嫁接含假 Nt-Cys/Ser 的底物类似物（如 CP6-L8K-Ser、CP6-L8d-Gly-Ser），成功解析复合物晶体结构（PDB: 9DXV、9DXB）。结果显示，Nt - 丝氨酸（Ser）或半胱氨酸（Cys）通过胺基和羟基 / 巯基与金属中心形成双齿配位（bidentate coordination），预留一个配位位点供氧气以端基取向（end-on orientation）结合，类似半胱氨酸双加氧酶（CDO）的机制。定点突变表明，ADO-Phe101（π- 堆积）、Tyr212（氢键）和 Asp206（催化）对底物结合和催化至关重要，其中 Asp206A 突变导致酶活丧失 99%，证实其作为关键催化残基的作用。

4. 催化机制与生理 relevance

MD 模拟显示，无论使用钴离子（Co2?）还是亚铁离子（Fe2?），Nt-Ser/Cys 均稳定结合金属中心，双齿配位模式在 100 ns 模拟中保持不变。结合光谱学数据，推测 ADO 通过形成铁 (III) 超氧中间体（iron (III) superoxo intermediate）启动催化，Asp206 可能通过定向或稳定活性氧中间体促进反应。此外，该研究首次揭示 ADO 与底物的结合模式，为解释其底物广谱性（如调控 RGS4/5、IL32 等）提供了结构依据。

结论与意义

本研究通过环肽支架嫁接策略，首次解析了 NCO 家族成员 ADO 的底物结合结构，揭示了双齿配位的金属结合模式及 Asp206 的催化机制。这些发现不仅填补了 NCOs 结构生物学的空白，也为设计靶向低氧疾病的小分子抑制剂提供了明确的结构模板。值得注意的是，研究中鉴定的保守残基（如 Asp206）在植物半胱氨酸氧化酶（PCOs）中高度保守，因此该成果对农业领域开发耐涝作物亦具有潜在指导意义。未来，基于该结构的药物优化有望推动低氧相关疾病（如癌症、缺血性心脏病）的治疗进展，并为理解生物氧气感知机制提供新范式。