基于Mirror正向遗传学方法揭示人类核内非编码RNA调控通路及其在口腔-面部-指综合征中的新机制

为解决核内非编码RNA（ncRNA）功能通路难以通过正向遗传学筛选的难题，研究人员开发了单细胞荧光报告系统Mirror，成功鉴定了MALAT1 RNA 3'端成熟与降解通路的关键组分，包括RNase P、RNA Exosome、NEXT复合物及DDX59 helicase。研究发现DDX59缺失导致U12内含子滞留，影响RNA Exosome功能并关联口腔-面部-指综合征（OFD），为核内RNA代谢与疾病机制研究提供了新工具和靶点。

核内非编码RNA（ncRNA）在疾病中扮演关键角色，但因其严格核定位特性，相关调控通路的正向遗传学研究长期受阻。以MALAT1为例，这种与肺癌、胰腺癌等转移相关的长链非编码RNA（lncRNA），其3'端通过RNase P切割形成特殊的tRNA-like结构（mascRNA），并由三链螺旋ENE元件保护免受核内降解。然而，哪些人类通路参与其加工与降解，以及如何与疾病关联，仍是未解之谜。

为解决这一难题，耶鲁大学的研究团队开发了创新的Mirror正向遗传学方法。该方法通过将核内ncRNA活性“镜像”为胞质荧光信号，首次实现了对核内ncRNA通路的全基因组筛选。研究通过双轮CRISPR sgRNA文库筛选，结合单细胞荧光激活分选（FACS）和深度测序，鉴定了MALAT1调控网络的核心组分。

关键技术包括：1）构建携带野生型/突变型ENE-mascRNA的荧光报告系统；2）基于CRISPR-Cas9的全基因组筛选；3）RNA-seq分析U12内含子滞留效应；4）Actinomycin D处理追踪RNA降解动力学。

主要研究结果：

核内通路的高效鉴定
Mirror筛选成功捕获了RNase P全部10个蛋白组分中的9个（如RPP14、POP1等），RNA Exosome 11个组分中的9个（如EXOSC10、DIS3等），以及NEXT复合物的RBM7和SKIV2L2。这些因子敲除后，荧光报告信号显著增强2-15倍，验证了其对MALAT1 3'端稳定性的调控作用。

DDX59的意外角色
DEAD-box helicase DDX59被首次发现参与核内RNA降解。敲除DDX59导致：1）MALAT1(C8351G)突变体稳定性增加；2）小核RNA（snRNA）3'端延伸形式积累；3）RNA Exosome组分（EXOSC1/2/5）和NEXT复合物支架蛋白ZCCHC8的mRNA中U12内含子广泛滞留，暗示其通过影响次要剪接体功能间接调控RNA降解。

与OFD综合征的分子关联
DDX59缺陷导致OFD相关基因（如C2CD3、TCTN3）的U12内含子滞留，这些基因编码纤毛功能蛋白。这一发现揭示了DDX59突变引发OFD的潜在机制：次要剪接体功能障碍→纤毛相关基因表达异常→发育缺陷。

BRF2调控RNase P活性
TFIIB-like因子BRF2通过调控Pol III转录的RPPH1（RNase P的RNA催化亚基）表达，影响MALAT1 3'端成熟。BRF2敲除使未加工的MALAT1-mascRNA前体增加12倍。

结论与意义
该研究突破了核内ncRNA通路研究的遗传学技术瓶颈，Mirror系统可高效鉴定直接/间接作用的必需基因。发现DDX59通过U12内含子剪接调控RNA Exosome功能，不仅解释了其与OFD的关联，还为癌症中MALAT1过表达提供了干预靶点。论文发表于《Nature Communications》，为核内RNA代谢与人类疾病研究开辟了新范式。