基于SpyTag-SpyCatcher反应的功能性蛋白质修饰超分子聚合物研究

推荐：本研究针对超分子生物材料功能化局限性问题，创新性地利用SpyTag-SpyCatcher技术，实现了全长蛋白质（如抗体）与UPy超分子纤维的共价偶联。通过5:95 mol% UPy-SpyTag/UPy-G共组装体系获得100%转化率，并成功将抗EGFR抗体Cetuximab定向修饰至纤维表面，证实了该平台在细胞靶向治疗中的潜力，为生物材料功能化提供了普适性策略。

　　

在生物医学领域，如何赋予合成材料精确的生物功能一直是重大挑战。传统超分子材料如脲嘧啶酮（UPy）聚合物虽能通过氢键自组装形成纳米纤维，但其功能化通常局限于小分子肽段，难以整合具有复杂结构的全长蛋白质。这严重限制了材料在免疫调节、靶向治疗等高端应用中的潜力。更棘手的是，现有蛋白质偶联方法（如NHS酯修饰）存在位点非特异性问题，而高温或有机溶剂等组装条件又会破坏蛋白质活性。

针对这些瓶颈，荷兰特文特大学的研究团队在《Bioconjugate Chemistry》发表了一项突破性研究。他们巧妙地将第三代SpyTag003/SpyCatcher003技术（一种通过天然肽键实现快速共价连接的生物偶联系统）与UPy超分子体系结合，创建了可精准修饰功能性抗体的新型平台。该技术的关键突破在于：在仅含5 mol% UPy-SpyTag的共组装体系中，实现了SpyCatcher融合蛋白100%的偶联效率，且全程在生理条件下完成，完美保留了蛋白质活性。

研究主要采用四大关键技术：1）固相肽合成制备SpyTag修饰的UPy单体；2）温度引导的超分子自组装形成μm级纤维；3）LC-MS Q-TOF和SDS-PAGE定量分析偶联效率；4）TIRF显微镜和cryo-TEM联用验证纤维-蛋白质共定位。特别值得注意的是，团队从胰腺癌细胞系BxPC3（高表达EGFR）获取实验样本，确保了生物学相关性。

分子设计与组装行为
通过系统比较不同UPy-SpyTag组装体的临界聚集浓度（CAC），发现5:95 mol%的UPy-SpyTag/UPy-G共组装体既能保持2 μM的低CAC，又可形成μm级纤维（cryo-TEM验证）。而纯UPy-SpyTag因电荷排斥无法成纤，证实了共组装策略的必要性。

SpyCatcher-mNeonGreen高效偶联
在优化条件下，游离UPy-SpyTag与SpyCatcher-mNeonGreen（SC-mNG）的偶联效率达90%，质量谱检测到预期3091 Da的增量。共组装纤维的偶联效率稍降至73%，但TIRF显示mNeonGreen荧光与Cy5标记的UPy纤维完美共定位，证实蛋白质在纤维上的均匀分布。

抗体功能化与细胞靶向
通过LASIC技术（一种基于pBPA光交联的抗体定向偶联方法），将抗EGFR抗体Cetuximab与pG₂-SpyCatcher/UPy纤维复合。尽管抗体偶联率仅50%，但共聚焦显微镜显示：仅Cetuximab修饰的UPy纤维能特异性结合BxPC3细胞膜，而对照组未见结合，证明抗体活性完全保留。

这项研究的意义在于：首次实现了全长抗体与超分子纤维的位点特异性偶联，突破了传统材料只能整合短肽的局限。通过模块化设计（如正交的DogTag/DogCatcher系统），该平台可扩展至多种蛋白质的并行修饰。在应用层面，这种能精确靶向细胞表面受体（如EGFR）的功能材料，为下一代靶向药物递送、免疫治疗支架开发奠定了基础。更值得关注的是，研究中建立的"先组装后修饰"策略，为其他超分子体系（如肽基水凝胶）的功能化提供了普适性范式。