基于LIMITS人工智能引导的宿主防御肽设计：突破抗结核药物研发的数据限制瓶颈

针对抗结核宿主防御肽(HDPs)设计面临的数据集小和序列空间大的挑战，研究人员开发了LIMITS（Lead Informed Machine Interrogation of Therapeutic Sequences）人工智能工作流。通过结合随机森林和神经网络模型，仅用约100个肽段数据即成功预测出对结核分枝杆菌(Mtb)具有高活性（MIC低至1.25μM）、高选择性（SI>16）和低毒性（TI>100）的新型HDPs。该研究不仅发现肽段长度（13-mer）是抗结核活性的关键因素，还揭示了无序结构HDPs的新作用机制，为数据受限条件下的抗菌肽设计提供了新范式。

　　

结核病仍是全球最致命的传染病之一，而结核分枝杆菌(Mtb)对现有抗生素日益严重的耐药性使得研发新型抗菌药物迫在眉睫。宿主防御肽(HDPs)作为天然免疫系统的抗菌分子，因其不易诱发耐药性而备受关注。然而传统HDPs存在两大瓶颈：一是庞大的序列空间（如13肽就有20¹³种可能）使筛选效率低下；二是针对非ESKAPE病原体（如Mtb）的高质量数据集严重不足。更棘手的是，HDPs难以通过细菌发酵表达，必须化学合成，这进一步限制了大规模筛选。

为解决这些难题，某国外研究团队在《Biomacromolecules》发表创新研究，开发了名为LIMITS（Lead Informed Machine Interrogation of Therapeutic Sequences）的人工智能工作流。该技术突破性地将机器学习与遗传算法结合，仅需约100个肽段数据即可高效预测抗结核HDPs。研究以人工设计的MAD1肽（模拟分枝杆菌孔蛋白MspA结构）为模板，通过系统截短和丙氨酸扫描确定最小活性序列（13-mer）和关键位点后，采用随机森林和神经网络（12层5神经元）模型，基于13种生物物理特征（如净电荷、疏水矩等）进行预测。实验验证显示，最优肽MAD5.3对Mtb H37Rv的MIC达1.25μM，选择性指数>16，且对A549细胞的毒性指数>100，较母体MAD1肽（MIC=10μM）有显著提升。

关键技术包括：1）基于遗传算法的序列进化（50代迭代）；2）随机森林与神经网络的双模型验证；3）针对Mtb H37Rv等5种分枝杆菌的MIC测定；4）营养饥饿和缺氧条件下的持久菌杀灭实验；5）膜渗透性（NPN摄取）和溶血性检测；6）与6种临床抗生素的组合效应（FIC指数）分析。

【LIMITS工作流】研究团队创新性地将实验与计算相结合：首先对MAD1进行截短扫描发现13-mer为最小活性单元，丙氨酸突变揭示C端色氨酸为关键位点。随后通过遗传算法（50%交叉率、0.025突变率）生成100个候选肽，经机器学习筛选前十名进入下一代优化。该工作流成功规避了传统方法需要数千序列数据的限制。

【机器学习性能】在模型构建中，12层5神经元神经网络表现最优（R²=0.90），其预测的肽段在外部验证集中保持良好准确性（MSE<0.2）。有趣的是，随机森林模型快速收敛于局部最优解，而神经网络能更充分地探索序列空间，这解释了为何后者预测的MAD5家族肽（含聚精氨酸区块）展现出更优异的性能。

【体外活性验证】实验证实AI设计的肽具有显著优势：MAD5.3对Mtb H37Rv的MIC（1.25μM）比MAD1提高8倍；对非分枝杆菌（如肺炎克雷伯菌）的MIC>80μM，显示优异选择性；更令人惊喜的是，在营养饥饿和缺氧条件下，MAD2.2能使持久菌减少>2 log，优于对照药物异烟肼（完全无效）和莫西沙星。

【生物物理机制】主成分分析揭示抗结核HDPs存在两个特征簇：典型簇（负PC1）与净电荷、疏水矩相关；非典型簇（正PC1）则与聚集倾向和无序结构相关，这打破了抗菌肽必须具有两亲性α螺旋的传统认知。尤为关键的是，13-mer长度与分枝杆菌外膜厚度（~6nm）的匹配性被发现是此前未被重视的活性决定因素。

【治疗价值】组合实验显示所有HDPs与一线抗结核药均呈相加效应（0.5

这项研究的意义在于：1）建立了数据受限条件下HDP设计的通用框架；2）发现13-mer是抗结核肽的"黄金长度"；3）揭示了无序结构HDPs的新作用模式；4）为清除持久菌提供了新策略。LIMITS工作流的