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为解决 hiPSC 疗法临床试验效果有限、成本制约研究通量问题，研究人员开展 hiPSC 生物工艺缩小优化研究。在 < 20 mL 规模下优化单细接种和聚集体预形成，发现搅拌速率可调控聚集体特征，细胞扩增倍数与商业系统相当，且细胞保持多能性。该成果助力加速 hiPSC 研究。
在再生医学领域，人类诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cells, hiPSCs）因其可分化为多种细胞类型的特性，成为细胞治疗和疾病研究的重要工具。然而，当前 hiPSC 衍生疗法在临床试验中普遍面临疗效有限的困境，这反映出科学界对调控细胞表型的分子网络理解不足。同时，传统大规模培养系统成本高昂，严重限制了对人工微环境（如供体差异、培养基成分等）与细胞 outcomes 关联的高通量研究。如何在降低成本的同时实现 hiPSC 高效扩增，成为推动再生医学发展的关键挑战。
为突破上述瓶颈，加拿大卡尔加里大学（University of Calgary）的研究团队开展了一项针对 hiPSC 生物工艺的缩小优化研究。相关成果发表在《Biotechnology Reports》，为 hiPSC 研究提供了经济高效的新范式。
研究人员主要采用了以下关键技术方法：
- 细胞培养与操作：使用 hiPSC 系 PGPC14，通过静态贴壁培养、冷冻保存及复苏等操作制备起始细胞材料。
- 聚集体预形成：在非贴壁 6 孔板中通过调节细胞密度（1×10?至 4×10? cells/cm2）形成均匀聚集体，并通过成像和粒径分析评估聚集体特征。
- 动态培养系统：将预形成的聚集体转移至搅拌悬浮反应器，设置 100、120、150 RPM 三种搅拌速率，进行 3 天动态培养，同时设置静态对照。
- 细胞表征：利用流式细胞术检测多能性标志物（OCT4、Sox2、Nanog 等）表达，通过畸胎瘤 assay 验证细胞多能性，结合图像处理和统计分析评估细胞生长动力学和聚集体形态。
3.1 单细胞接种与聚集体预形成方案评估
研究发现，单细胞接种在搅拌条件下无法形成聚集体且细胞生长停滞，而聚集体预形成显著促进细胞增殖。在 1×10? cells/cm2 密度下预形成的聚集体呈均匀球形，经动态培养后，150 RPM 条件下细胞扩增倍数达 7.6， viability 维持在 80% 以上。进一步研究表明，接种密度直接影响聚集体粒径分布：低密度下形成小而均匀的聚集体，高密度则导致大粒径且分布不均。
3.2 动态培养中聚集体增殖优化
搅拌速率对聚集体生长和形态具有显著调控作用：150 RPM 时细胞扩增倍数最高（13.2±0.81），聚集体粒径最小（283±69 μm）且分布均匀；100 RPM 时扩增倍数最低（6.8±0.75），粒径最大（425±87 μm）。这表明较高搅拌速率通过增强剪切力促进聚集体分散，进而提升细胞增殖效率。
3.3 多能性特征与功能验证
流式细胞术显示，动态培养下 hiPSCs 维持高表达多能性标志物（OCT4、Sox2、Nanog、SSEA4 均 > 95.9%），且 TRA-1-81 表达显著高于静态培养。畸胎瘤 assay 证实，培养的 hiPSCs 可分化形成内、中、外三胚层组织，表明其功能多能性未受培养条件影响。此外，动态培养后的细胞经静态传代后，形态、标志物表达和增殖能力均与传代前一致，验证了培养系统的稳定性。
4.1 聚集体预形成对缩小培养的关键作用
研究指出，缩小培养系统中单细胞无法自发形成聚集体，而静态预形成步骤通过促进细胞间信号传导和迁移，有效克服了这一缺陷。ROCK 抑制剂 Y27632 的应用在维持细胞存活的同时，可能通过调节细胞骨架影响聚集体结构，为优化聚集体形成机制提供了新方向。
4.2 搅拌速率与聚集体动力学的关联
动态培养中缺乏延迟期表明，预形成聚集体可快速适应流体环境，避免了大规模单细胞接种时因聚集体形成滞后导致的生长停滞。尽管本研究未涉及计算流体动力学分析，但搅拌速率与聚集体粒径的负相关性提示，流体剪切力可能通过影响细胞 - 细胞相互作用调控聚集体生长，这为后续放大培养的参数优化提供了理论依据。
4.3 培养条件对多能性的影响
动态培养下 TRA-1-81 表达升高，暗示流体环境或化学定义基质可能调控细胞表面标志物。传代实验表明，hiPSCs 在动态与静态培养间可稳定过渡，但其长期传代的遗传稳定性仍需进一步研究，以排除表观遗传异常或基因突变的潜在风险。
4.4 研究局限与未来方向
本研究仅为单代培养评估，未涉及连续传代对细胞状态的影响，且缺乏流体力学的定量分析。未来需结合计算模型和多代培养，系统解析微环境参数（如剪切力、营养梯度）对 hiPSC 表型的长期调控机制，为开发标准化、可放大的 hiPSC 培养工艺奠定基础。
这项研究成功建立了 10-18.5 mL 规模的 hiPSC 缩小培养系统，通过聚集体预形成和搅拌速率调控，实现了与商业系统相当的扩增效率，同时保持细胞多能性。该方案显著降低了高通量研究成本，为深入解析 hiPSC 表型与微环境的动态关联提供了有力工具，有望加速 hiPSC 在再生医学中的临床转化，推动细胞治疗成为更高效的临床解决方案。
