通过PKC与钙信号通路激活实现CAR-NK细胞的无饲养细胞生产

为解决CAR-NK细胞生产过程中饲养细胞（如K562）带来的污染风险、批次差异及高成本问题，FDA研究人员开发了基于佛波酯（PMA）和钙离子载体（ionomycin）的无饲养细胞（FCF）激活方法。研究表明，FCF法在大规模生产中不仅保持CAR表达水平，还显著提升细胞效力并降低髓系细胞激活，为安全、高效的CAR-NK生产提供新策略。

　　

论文解读

在肿瘤免疫治疗领域，自然杀伤（NK）细胞经基因改造表达嵌合抗原受体（CAR）后，展现出“通用型”治疗的潜力——无需匹配患者HLA类型即可杀伤肿瘤细胞。然而，CAR-NK细胞的体外生产却面临巨大挑战：传统方法依赖肿瘤来源的饲养细胞（如K562）激活NK细胞，不仅可能引入外源污染物，还导致批次间质量波动，且饲养细胞的制备与质控成本高昂。这些问题严重制约了CAR-NK疗法的安全性与规模化应用。

美国FDA生物制品评价与研究中心（CBER）的研究团队另辟蹊径，从T细胞研究中获得灵感：此前他们发现，佛波酯（PMA）和钙离子载体（ionomycin）能绕过T细胞受体（TCR），通过激活蛋白激酶C_(PKC)和钙信号通路直接刺激T细胞。由于NK细胞的活化同样依赖这两条通路，团队大胆假设——PMA/ionomycin组合或许能替代饲养细胞，实现CAR-NK的无饲养细胞（FCF）生产。

关键技术方法
研究采用健康供体外周血单核细胞（PBMC）分离NK细胞，对比传统饲养细胞法（FCB）与FCF法（PMA/ionomycin激活）的生产效果。关键步骤包括：1）Src激酶抑制剂PP2预处理以增强信号传导；2）慢病毒载体转导CAR基因；3）多批次小规模与大规模生产比较；4）通过流式细胞术、细胞毒性实验等评估关键质量属性（CQAs）。

研究结果

Src-kinase抑制剂增强NK细胞无饲养细胞激活
加入PP2后，NK细胞经PMA/ionomycin刺激时，核因子NFAT₁信号通路活性显著提升，证实Src激酶抑制可优化FCF法的激活效率。

小规模与大规模生产的质量属性对比

• 小规模实验：FCF法的CAR表达率略低于FCB法，但其他CQAs（如增殖能力、表型标志物）相当。
• 大规模生产：FCF法CAR表达与FCB法持平，且细胞杀伤活性（potency）提高30%，同时减少了对髓系细胞的非特异性激活——后者是传统方法常见的副作用。

讨论与意义
这项发表于《Cytotherapy》的研究首次证明，通过PKC/钙信号通路直接激活NK细胞，可摆脱对肿瘤源性饲养细胞的依赖。FCF法不仅规避了污染风险，还简化了生产流程、降低了成本，更在大规模应用中展现出更优的细胞质量。尤其值得注意的是，FCF法减少髓系细胞激活的特性，可能降低临床治疗中的细胞因子风暴风险。

研究团队（作者包括Supreet Khanal等）强调，该策略为CAR-NK的“即用型”治疗铺平了道路。未来，结合自动化生物反应器技术，FCF法有望成为CAR-NK标准化生产的金标准。这一突破不仅适用于癌症治疗，也为感染性疾病、自身免疫病等领域的NK细胞疗法开发提供了新范式。