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为解决 NEIL1 内源性表达低、商用抗体特异性不足等问题，研究人员开发靶向 NEIL1 的单域纳米抗体（VHHs）。经酵母双杂交（Y2H）筛选出候选 A5，其能特异性结合 NEIL1 N 端糖基化酶结构域，不干扰酶活性，且 A5-mCherry 显色体可用于活细胞成像追踪 NEIL1 动态，为相关研究提供新工具。
在生命科学领域，DNA 损伤与修复机制一直是备受关注的重要课题。碱基切除修复（BER）作为细胞抵御内源性和外源性 DNA 损伤的 “前沿防线”，其关键酶的功能研究对理解基因组稳定性与疾病发生至关重要。Nei 内切核酸酶 VIII 样 1 蛋白（NEIL1）作为 BER 通路中的双功能 DNA 糖基化酶，能识别并切除胸腺嘧啶乙二醇、8 - 氧代鸟嘌呤（8-oxoG）等氧化碱基，在维持基因组完整性中扮演关键角色。然而，NEIL1 在细胞内源性表达水平显著低于 OGG1、Polβ、APE1 等其他 BER 蛋白，导致多数研究依赖过表达系统。同时，市售抗体常因特异性差、供应不稳定，严重阻碍了 NEIL1 的功能研究，尤其是其在 DNA 损伤响应中的动态追踪和内源性调控机制的探索。
为突破这些瓶颈，美国南阿拉巴马大学健康米切尔癌症研究所（University of South Alabama Health Mitchell Cancer Institute）的研究团队与 Hybrigenics Services SAS（法国巴黎）合作，开展了靶向 NEIL1 的新型纳米抗体开发研究。研究成果发表在《DNA Repair》，为 NEIL1 相关研究提供了关键工具。
研究主要采用以下技术方法：
- 酵母双杂交筛选（Y2H）：利用含 2×10?克隆的 Nali-H1 酵母全合成单域抗体库，筛选出 10 个靶向 NEIL1 的 VHH 候选克隆，其中 A5 多次出现并作为重点研究对象。
- 生化与分子表征技术：通过差示扫描荧光法（DSF）验证 A5 与 NEIL1 的结合特异性；利用糖基化酶活性测定，确认 A5 不干扰 NEIL1 的催化功能；通过活细胞成像技术，观察 A5-mCherry 显色体与 NEIL1-GFP 的共定位及 DNA 损伤位点募集情况。
研究结果
新型 NEIL1 纳米抗体的筛选与表达
通过 Y2H 筛选 9.8×10?个克隆，初筛获得 3 个阳性克隆，进一步验证后确定 10 个 VHH hits，其中 A5 因重复出现且结合性能突出成为最优候选。研究人员将 VHH 序列克隆至含组氨酸（His）和 Flag 标签的载体，实现其在大肠杆菌和哺乳动物细胞中的表达与纯化，为后续功能研究奠定基础。
A5 与 NEIL1 的结合特性
DSF 结果显示，A5 能特异性稳定重组表达的 NEIL1，且对其热稳定性的提升具有剂量依赖性。进一步通过竞争结合实验证实，A5 优先结合 NEIL1 的 N 端糖基化酶结构域，而非参与蛋白互作的 C 端柔性尾区。这一特性表明 A5 可在不干扰 NEIL1 与下游 BER 因子相互作用的前提下，实现对其的特异性识别。
A5 对 NEIL1 酶活性的影响
糖基化酶活性测定表明，A5 与 NEIL1 结合后，不影响其切除氧化碱基的催化效率，也不干扰 DNA 链断裂的 lyase 活性。这说明 A5 是一种 “功能惰性” 结合工具，适用于需要保留 NEIL1 酶活性的生化研究，如 BER 通路动态监测。
活细胞成像验证 A5 的应用潜力
构建 A5-mCherry 融合蛋白（显色体）后，在活细胞中观察到其与 NEIL1-GFP 的显著共定位，尤其在激光诱导的 DNA 损伤位点，A5-mCherry 被快速募集至损伤区域，与 NEIL1 的修复动力学一致。这证实 A5 可作为分子探针，实时追踪 NEIL1 在活细胞内的动态分布与损伤响应过程。
研究结论与意义
本研究成功开发了首个特异性靶向 NEIL1 的纳米抗体 A5，其兼具高结合特异性和功能兼容性，为 NEIL1 的基础研究与转化应用开辟了新路径。
- 方法学突破：A5 克服了传统抗体的局限性，其较小的分子尺寸（单域结构）使其能穿透复杂组织微环境，适用于活体成像和原位检测；模块化设计便于与荧光蛋白融合，为多色成像和蛋白互作研究提供了灵活工具。
- 科学发现价值：通过 A5 的应用，首次在活细胞水平直观揭示 NEIL1 的 DNA 损伤响应动力学，为解析其与其他 BER 蛋白（如 OGG1、APE1）的协同作用机制提供了新视角。研究还发现 NEIL1 的 N 端结构域是其核心识别位点，为后续基于结构的抑制剂设计奠定了基础。
- 转化医学前景：纳米抗体的细菌高效表达特性（单外显子编码）使其具备低成本规模化生产潜力，未来可开发为诊断试剂（如免疫组化检测 NEIL1 表达）或治疗性分子（如靶向递送 DNA 修复增强剂至损伤位点）。
尽管 A5 的体外结合亲和力为微摩尔级，研究团队后续计划通过噬菌体展示技术优化其亲和力至纳摩尔级，并拓展其在 DNA 修复缺陷相关疾病（如癌症、神经退行性疾病）模型中的应用。该研究不仅填补了 NEIL1 研究工具的空白，更凸显了纳米抗体技术在解析复杂蛋白动态功能中的独特优势，为 BER 通路及其他低丰度靶点的研究提供了可借鉴的方法论。
