ω-转氨酶结合口袋与通道工程改造高效合成(R)-1-苯氧基丙-2-胺

本研究针对ω-转氨酶(TA)底物范围窄及抑制效应等问题，通过理性设计结合位点(H62A/Y122A突变)和重塑通道结构(NsTAD7截短)，显著提升NsTA对1-苯氧基丙酮的催化效率（最高2倍），实现5 mM底物4小时完全转化且ee值>99%，为手性胺类药物中间体合成提供了高效生物催化策略。

　　

在制药和农业化学领域，手性胺类化合物作为关键砌块的需求日益增长。传统化学合成依赖过渡金属催化剂和复杂配体，存在环境负担重、光学纯度低等问题。生物催化尤其是转氨酶(TA)催化的不对称胺化反应，因其高立体选择性和绿色工艺特性备受关注。然而，野生型ω-转氨酶(ω-TA)普遍存在两大瓶颈：一是活性口袋对空间位阻敏感，难以催化大体积底物；二是底物/产物抑制效应严重制约工业化应用。以抗心律失常药美西律的关键中间体(R)-1-苯氧基丙-2-胺为例，现有生物催化路线或需额外辅酶再生系统，或转化率不足81%，亟需开发更高效的酶催化剂。

浙江理工大学的研究团队选择Nocardioides sp. CER19来源的R选择性ω-TA(NsTA)为研究对象，该酶独特偏好异丙胺(IPA)作为氨基供体，可避免复杂辅酶再生系统。通过结合口袋工程和通道改造的双重策略，成功获得催化性能显著提升的突变体，相关成果发表于《Enzyme and Microbial Technology》。研究采用分子对接识别关键位点，通过丙氨酸扫描突变(H62A/Y122A)扩大结合口袋；利用CAVER软件分析通道瓶颈，采用N端7氨基酸截短(NsTA_D7)重塑通道结构；结合分子动力学(MD)模拟阐释构效关系。

理性设计NsTA结合口袋催化底物1a
通过对接1-苯氧基丙酮(1a)发现H62和Y122形成空间位阻。H62A突变使转化率提升至100%（野生型66%），MD模拟显示该突变增强蛋白质柔性，可能缓解底物抑制。Y122A突变则使酶活提高1.5倍，双突变体未展现叠加效应，暗示两个位点存在协同作用。

通道工程优化产物释放
野生型NsTA存在长而扭曲的通道，N端α螺旋形成入口瓶颈。NsTA_D7截短突变使转化率提升1.6倍，通道分析表明该改造扩大了通道截面积，可能促进产物扩散。

结论与意义
该研究通过精准调控NsTA的微环境，获得H62A/Y122A/D7三个优势突变体，使5 mM 1a在4小时内完全转化为(R)-2a（>99% ee）。创新性体现在：首次报道NsTA的通道工程策略，为克服ω-TA的产物抑制提供新思路；建立的"结合口袋-传输通道"双轨改造方案，可拓展至其他大体积底物催化体系。这项工作不仅实现了美西律前体的高效合成，更为工业级生物催化剂的开发提供了普适性方法学指导。分子柔性调控与通道重塑的协同机制，也为理解酶工程中的动态结构-功能关系提供了新视角。