CRB1基因突变致视网膜色素上皮细胞结构与功能异常的机制研究及PDMS微孔平台培养新策略

为解决CRB1突变相关视网膜病变的机制不明问题，研究人员通过患者来源iPSCs构建RPE疾病模型，发现突变导致细胞形态异常、紧密连接缺陷及吞噬功能障碍，并创新性采用PDMS微孔平台实现RPE细胞三维聚集培养，显著提升细胞活性和功能，为疾病机制解析及细胞治疗提供新思路。

　　

论文解读

视网膜色素上皮细胞（RPE）是维持视觉功能的关键细胞层，其功能障碍会导致视网膜色素变性（RP）等致盲性疾病。CRB1基因编码的Crumbs同源蛋白对维持RPE细胞极性和粘附至关重要，但超过300种CRB1突变如何具体影响RPE仍不明确。传统动物模型因物种差异存在局限性，而诱导多能干细胞（iPSCs）技术为构建人源化疾病模型提供了新途径。然而，现有iPSC-RPE分化方法效率参差，且缺乏模拟体内微环境的培养体系。

为解决这些问题，长沙爱尔眼科医院的研究团队利用携带CRB1双突变（c.2249G>A和c.2809G>A）的RP患者iPSCs，首次建立了疾病特异性RPE模型，并创新性地采用聚二甲基硅氧烷（PDMS）微孔平台进行三维聚集培养。研究发现发表于《Experimental Eye Research》，揭示了CRB1突变导致RPE结构和功能的分子机制，同时开发了提升细胞活性的新型培养策略。

关键技术方法
研究通过2D直接分化和3D视网膜类器官分化两种途径获得iPSC-RPE，比较其分子表型差异；利用CRB1突变患者来源iPSCs构建疾病模型，结合透射电镜、免疫荧光和跨上皮电阻（TEER）检测细胞形态与功能；采用PDMS微孔平台实现RPE三维聚集培养，并通过RNA测序分析转录组变化；实验数据来自经伦理审查的患者样本（批准号KYPJ005）。

研究结果

RPE细胞二维与三维分化特性比较
对比2D直接分化和3D视网膜类器官分化获得的RPE细胞，两者均呈现典型鹅卵石样形态和黑色素沉积，但3D分化细胞表达更高水平的RPE标志物（MITF、RPE65），且紧密连接蛋白ZO-1分布更连续，提示3D分化可能更接近生理状态。

CRB1突变RPE的病理特征
患者来源RPE表现出异常形态、稀疏的顶端微绒毛和紧密连接结构紊乱。功能检测显示突变细胞屏障功能受损（TEER值降低），荧光分子跨膜转运增加，吞噬光感受器外节的能力显著下降。转录组分析揭示细胞连接相关基因（如CLDN19、OCLN）表达下调，与表型相符。

PDMS微孔聚集培养的增效作用
在PDMS微孔中形成的RPE细胞聚集体表现出更强的存活率和功能活性：

• 抗上皮-间质转化（EMT）标志物（如E-cadherin）上调
• 衰老相关基因（CDKN2A）和凋亡标志物（CASP3）表达降低
• 细胞外基质重塑相关通路激活，可能通过力学刺激改善细胞微环境

讨论与意义
该研究首次系统阐明了CRB1突变导致RPE细胞结构和功能缺陷的分子机制，包括紧密连接破坏、极性丧失和吞噬功能障碍，这些发现为理解CRB1相关RP的发病机制提供了细胞水平证据。创新的PDMS微孔聚集培养技术不仅解决了传统2D培养中RPE细胞活性不足的问题，还通过抑制EMT和衰老途径显著提升细胞功能，为RPE的长期培养、运输及移植提供了标准化方案。

从转化医学角度看，该模型可作为药物筛选平台，而PDMS培养策略有望优化细胞治疗产品的制备流程。未来研究可进一步探索CRB1突变影响RPE-光感受器相互作用的分子途径，以及PDMS微孔物理特性（如硬度、孔径）对RPE功能的调控机制。这项研究为遗传性视网膜疾病的精准医疗奠定了重要基础。