MePCE通过协调DNA双链断裂处的R-loop解离促进同源重组修复

这篇研究揭示了甲基磷酸帽酶(MePCE)在DNA损伤修复中的新机制。研究发现7SK RNA甲基转移酶MePCE被动态招募到双链断裂(DSB)位点，以与BRCA1协同的方式促进R-loop解离和同源重组(HR)修复。这项工作不仅阐明了染色质相关MePCE与DNA修复因子的相互作用网络，还为BRCA1缺陷型癌症的病因和治疗提供了重要见解。

　　

MePCE促进同源重组通过协调DNA双链断裂处的R-loop解离

Highlights
• MePCE 7SK RNA甲基转移酶被动态招募到双链断裂(DSB)位点
• MePCE在特定基因组位点促进DSB处的R-loop解离
• MePCE以与BRCA1协同的方式促进同源重组修复
• MePCE和BRCA1缺陷导致LARP7异常定位于R-loop和DSB位点

Summary
MePCE是一种多功能蛋白，通过7SK核糖核蛋白复合体(7SK RNPc)调控正性转录延伸因子b(P-TEFb)在核质和染色质之间的分配。虽然MePCE在核质中隔离P-TEFb的作用已被阐明，但其在染色质上的功能仍不清楚。最新研究发现染色质相关的MePCE与R-loop加工和DNA修复因子相互作用。MePCE被招募到DNA双链断裂位点，其缺失会损害同源重组修复，减少RAD51装载，并在AsiSI诱导的DSB处增加特定基因组位点的R-loop水平。此外，MePCE缺失还增加了7SK RNPc另一组成成分LARP7与R-loop的相互作用，而正常情况下LARP7会在DSB时被BRCA1/BARD1降解。这些发现揭示了7SK RNPc在DSB修复过程中的动态调控机制，解释了近期观察到的MePCE与BRCA1缺陷的合成致死效应。

Introduction
正性转录延伸因子b(P-TEFb)激酶活性是释放RNAP II从暂停状态进入延伸状态的关键分子开关。P-TEFb活性本身受到其整合入7SK核糖核蛋白(RNP)复合体的调控，7SK是人类细胞中最丰富的小核RNA(snRNA)。甲基磷酸帽酶(MePCE)是一种多功能蛋白，首先通过甲基化7SK snRNA的新生5'三磷酸端启动7SK snRNP复合体形成，其次通过与7SK snRNA及7SK snRNP蛋白组分(包括P-TEFb)建立稳定相互作用来维持RNP稳定性。LARP7是一种La相关蛋白，通过结合7SK的3'-UUU保护7SK免于降解。

除了通过稳定核质中7SK RNP复合体发挥全局性P-TEFb抑制作用外，MePCE还具有局部P-TEFb激活作用，这涉及MePCE与染色质的结合。值得注意的是，MePCE敲除在小鼠(IMPC)和人类细胞(DepMap)中是致死性的，而LARP7则不是，这表明MePCE具有超出维持核质7SK RNP复合体池的重要功能。

近期研究发现7SK snRNP在DNA损伤应答和修复(DDR)中具有间接功能。特别是，Zhang等发现LARP7是BRCA1/BARD1介导的泛素化底物和同源重组修复途径的抑制因子。此外，在针对BRCA1突变乳腺癌和卵巢癌的CRISPR-Cas9筛选中，MePCE是从334个表观遗传调控基因和657个FDA批准药物靶基因中筛选出的唯一特异性候选基因。这种遗传互作被解释为破坏7SK复合体与BRCA1缺陷协同导致R-loop毒性积累和复制应激的间接效应。

Results
MePCE在染色质上的主要互作蛋白与DNA修复和R-loop相关
为阐明MePCE在染色质上的功能，研究人员比较了核质和染色质组分中MePCE互作蛋白。质谱分析鉴定出110个MNase预处理条件下的特异性MePCE-FLAG互作蛋白，其中68个与两个独立的RNA/DNA杂交体或R-loop互作蛋白数据集重叠。这些互作蛋白包括FACT复合体的SUPT16和SSRP1亚基、拓扑异构酶TOP1和TOP2A、RNA修饰酶(如NAT10 RNA乙酰转移酶)以及大量具有R-loop解旋功能的解旋酶。值得注意的是，许多这些因子在DNA损伤相关R-loop解离中具有明确作用。

MePCE被直接招募到激光诱导的DNA损伤和DSB位点
活细胞成像显示GFP-MePCE在DNA损伤位点快速积累，这种招募依赖于DNA损伤信号，因为PARP1抑制剂olaparib完全阻断了MePCE的早期招募。与MePCE不同，7SK RNPc的另一组成成分LARP7仅显示微弱但显著的招募，表明MePCE可能在7SK RNPc内被招募，但通过LARP7快速降解而释放。在AsiSI-ER诱导系统中，内源性MePCE与γH2AX共定位，证实MePCE可直接定位于DSB。

MePCE刺激DSB的同源重组修复
在AsiSI诱导系统中，MePCE与约40%的γH2AX foci共定位。HR报告实验显示MePCE敲低特异性影响HR修复效率。ChIP-seq分析发现MePCE敲低严重影响了RAD51在AsiSI位点的装载，但不影响XRCC4招募。与HR修复缺陷一致，AsiSi介导的γH2AX foci在siMePCE细胞中显著增加。

MePCE直接结合具有高水平R-loop的DSB断裂
ChIP-seq分析显示MePCE结合在AsiSI诱导的DSB断裂周围。线性回归分析发现MePCE敲低对29个位点的RAD51结合影响最大(降低超过1.5倍)。这些位点通常具有较大的MePCE结合域，且MePCE结合水平与R-loop水平显著相关。例如，在LINC01970位点，AsiSI介导的DSB诱导后，R-loop水平在修复过程中下降，而MePCE缺失则阻止了这种下降。

MePCE缺失增加DSB断裂处的R-loop水平
DRIP-seq分析显示MePCE敲低增加了DSB处的R-loop水平，这与AsiSI位点包含基因的转录水平无关。在U2OS-263细胞系中，siMePCE细胞在FokI焦点处显示出比siNC细胞更高的S9.6抗体染色水平。总体而言，数据显示siMePCE降低RAD51装载并增加DSB处的R-loop水平。

MePCE缺失影响DSB处R-loop互作蛋白的存在
DRIP-MS实验发现MePCE敲低降低了特定蛋白(如DDX54和FACT复合体)与R-loop的相互作用，同时增加了APOBEC3B等蛋白与R-loop的结合。特别值得注意的是LARP7在R-loop上的积累增加，这可能与BRCA1/BARD1介导的LARP7降解缺陷有关。

MePCE缺失增加LARP7向R-loop的招募
BRCA1敲除显著增加了γH2AX foci与LARP7共定位的比例，达到与MePCE招募相似的水平。这表明7SK RNPc被招募到DSB位点，随后LARP7被BRCA1/BARD1降解。MePCE缺失也导致LARP7积累，表明BRCA1可能需要MePCE来降解DSB处的LARP7。

LARP7缺失部分挽救BRCA1的HR缺陷
功能实验显示LARP7敲除不仅没有HR修复缺陷，甚至部分挽救了BRCA1缺失的效应，表明BRCA1在DSB的一个重要功能是诱导LARP7降解。相比之下，双重MePCE-BRCA1缺失没有比单独BRCA1缺失产生更大影响，表明MePCE对HR效率的影响与BRCA1协同。

Discussion