松弛素-3非选择性激活RXFP3和RXFP4受体的分子机制及结构基础研究

为解决G蛋白偶联受体RXFP3/RXFP4亚型选择性识别机制不明的问题，研究人员通过冷冻电镜技术解析了松弛素-3与RXFP3/RXFP4-Gi复合物的高分辨率结构（2.91-3.10 ?），揭示了其保守的跨膜域结合模式及关键残基R26B/W27B的激活作用，为神经代谢疾病靶向药物设计提供了结构依据。

　　

在神经科学和代谢疾病领域，松弛素家族肽受体RXFP3和RXFP4作为重要的G蛋白偶联受体（GPCR），通过调控神经肽信号参与摄食、应激和成瘾等生理过程。然而，其内源性配体松弛素-3（relaxin-3）能同时激活RXFP3和RXFP4，而胰岛素样肽5（INSL5）仅选择性结合RXFP4，这种差异化的识别机制长期未明。此外，现有小分子激动剂普遍存在亚型交叉反应性，制约了靶向药物的开发。

为解决这些问题，中国科学院上海药物研究所等单位的研究人员联合开展了系统性研究。他们采用冷冻电镜技术首次解析了松弛素-3与RXFP3-G_i（2.91 ?）、RXFP4-G_i（2.95 ?）以及小分子双激动剂compound 4-RXFP3-G_i（3.10 ?）的三维结构，结合突变分析和功能实验，揭示了配体识别和受体激活的分子机制。研究论文发表在《Communications Biology》上。

关键技术包括：1）利用BRIL（细胞色素b562RIL）融合和NanoBiT（纳米荧光素酶片段互补）策略稳定受体复合物；2）基于HEK293T细胞的cAMP抑制实验验证功能；3）冷冻电镜数据采集与三维重构（Titan Krios显微镜，K3探测器）；4）分子动力学模拟分析结合构象差异。

整体结构特征
通过冷冻电镜解析的复合物结构显示，松弛素-3的B链C端（R26^B/W27^B）以相似角度插入RXFP3和RXFP4的跨膜域（TMD）核心，而A链仅通过二硫键（C24^A-C22^B）稳定B链构象。与β₂-肾上腺素受体相比，TM6胞外端的外移表明受体处于完全激活状态。

双激动机制
研究发现，松弛素-3通过保守残基实现双受体激活：W27^B与RXFP3的W138^2.60（RXFP4为W97^2.60）形成π-π堆叠，并与T162^3.32（RXFP4为T121^3.32）产生氢键；R26^B则分别与RXFP3的Q367^7.31或RXFP4的E100^2.63形成极性相互作用。突变实验证实，E141^2.63A（RXFP3）和E100^2.63A（RXFP4）完全 abolished 配体活性。

小分子模拟策略
双激动剂compound 4通过吲哚核心模拟W27^B作用，与W138^2.60堆叠，其胍基与E141^2.63形成盐桥。但氯苯基取向差异导致其对RXFP4的活性（EC₅₀=2 nM）强于RXFP3（82 nM），这归因于RXFP3的S159^3.29/S16^3.33与羟基的极性作用被RXFP4的L118^3.29/V122^3.33疏水环境取代。

亚型选择性决定因素
与松弛素-3不同，INSL5的刚性C端α螺旋（A20^B/S21^B）阻碍其适应RXFP3结合腔，而松弛素-3的G23^B/G24^B柔性环可调整构象。此外，RXFP4的ECL2（F105^ECL1）与INSL5的Y17^B形成π-π堆叠，进一步强化选择性。

G蛋白偶联特性
RXFP3/RXFP4激活后均引起TM6胞内端外移（7.85 ?位移），但RXFP4通过ICL3的R234/R236/R237与Gα_i形成极性网络，而RXFP3仅依赖ICL2的R192与D194^G.s2s3.2盐桥维持相互作用。

该研究首次阐明了松弛素家族肽受体亚型选择性的结构基础，为设计靶向RXFP3/RXFP4的神经精神疾病药物（如酒精成瘾、应激障碍）提供了关键理论依据。通过揭示保守激活残基（W2.60/E2.63）和亚型特异性结合腔特征，研究提出了“避免核心机制+补偿性相互作用”的配体设计新策略，对GPCR家族其他亚型的精准调控具有借鉴意义。